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Team:Tokyo Metropolitan/Notebook
From 2011.igem.org
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Contents |
Lab Notebook
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Lab Protocols
PCR (PrimeSTAR® HS DNA Polymerase)
- Ice
- Micro pipette**Thermal cycler
- PCR Tube
- Micro Tube
- DW
- 5× PCR Buffer
- dNTP (2.5mM)
- Primer(Forward & Reverse) (20µM)
- Template DNA
- PrimeSTAR® HS DNA Polymerase (2.5U/μl)
- Add the all following components on ice.
- Mix thoroughly. Add
Electrophoresis
- Gel
- 泳動槽
- Parafilm
- Micro pipette
- TAE Buffer
- 6× Loading Buffer
- DW
- 5× PCR Buffer
- 泳動槽にゲルをセットし、TAE Bufferをゲルが浸るまで入れる。
- Loading Buffer・・・1µl
- DNA solution・・・5µl
- DW・・・5µlをParafilmの上で、ピペッティングにより混ぜ、ゲルのウェルに入れる。
- 電流を流し、泳動する。（100V：通常のとき、50V：ゆっくりと丁寧に流したいとき）
- 紫外光をあてバンドを確認する。
Ethanol precipitation
- Centrifuge
- Micro Tube
- Micro pipette
- Aspirator
- 99.5％Ethanol
- 3.0M Sodium acetate (pH5.2)
- TE Buffer
- 核酸（DNAまたはRNA）溶液に1/10量の3.0M Sodium acetateを加え混合する。
- 溶液100µlあたり1µl（溶液が400µl以下の時は4µl）のGenとるくんエタ沈キャリアーを加え混合する。
- 2.5倍量のEthanolを加え十分混合し、遠心(12000rpm,15min,4℃,)する。
- 遠心後、上清を除き、70%Ethanolを加え(3の総量と同量)混合し、遠心(12000rpm,5min,4℃,)する。＝洗い
- 遠心後、上清を除き、乾燥する。
- 適当量のDWまたは TE Bufferを加え、沈殿を再溶解する。
Plasmid Extraction
- Ice
- Micro Tube
- Micro pipette
- Centrifuge
- 50ｍM glucose ; 10mM EDTA ; 25ml Tris-HCl (pH 8.0)
- 5N NaOH
- 10％ SDS
- 3M Potassium Acetate (pH 4.8)
- 菌の前培養液を遠心(12000rpm,5min)し、上清を捨てる。
- 沈殿を50ｍM glucose; 10mM EDTA; 25mM Tris-HCl (pH 8.0) 100μlで再懸濁する。
- 0.2N NaOH; 1％ SDS（用時調整）200μlを加え混合し、氷上で5minインキュベートする。
- 3M Potassium Acetate (pH 4.8) 150μl を加えよく混合し、氷上5minインキュベートする。
- 遠心(12000rpm,5min)し、遠心後上清を回収する。
Digestion
- Micro Tube
- Micro pipette
- Heat Block or Water bus
- Digest Enzyme
- 10×Buffer
- DW
- Tubeに加え、混合する.
- 37℃でインキュベートする（2～16ｈ）
Ligation
- Micro Tube
- Micro pipette
- Heat Block
- T4 Ligase
- 10× Buffer
- DW
- Tubeに加え、混合する.
- 16℃でインキュベートする（30min～1ｈ）
Transformation
- Micro pipette
- Heat Block or Water bus
- ECOS™ Competent E. coli
- Plate (Antibiotic)
- Spreader
- 氷上でコンピテントセルを融解する。
- 4℃または氷上で冷却したプラスミド溶液またはライゲーション溶液(コンピテントセルの5％以下)を加える。
- 直ちにボルテックスで 1秒間撹拌する。
- 氷上で 5minインキュベートする。
- 直ちに 42℃で 45 secインキュベートする。
- 氷上で 2minインキュベートする。
- あらかじめ37℃で保温しておいた Hi-Competence Broth またはSOC培地を、コンピテントセルの 4倍量程度加え、37℃で30minインキュベートする（この作業はアンピシリン使用時省く）
- 100 µl～全量を LB Plateに移し均一に塗布する。
- 37℃で 12～16hインキュベートする.
Colony PCR(Takara EX® Taq)
- Plate
- Ice
- Micro pipette
- Thermal cycler
- Burner
- 70％EtOH
- Toothpick (爪楊枝)
- PCRTube
- Micro Tube
- Spreader
- DW
- 10× PCR Buffer
- dNTP (2.5mM)
- primer(Forward & Reverse) (20µM)
- Taq Polymerase
- 培養し、プレートに形成されたコロニーに番号を振る。（数が多い際は、他のコロニーと距離が離れている、コロニーが大きい等の基準から48のコロニーをピックアップする）
- 何も生やしていない抗生物質入りの培地の裏に、１で振った番号を等間隔に書きこむ。（このプレートをマスタープレートという）
- コロニーの数分、以下の組成でDW→Buffer→dNTP→primer→polymeraseの順に混ぜていく。調製は氷上で行う。
- 良く撹拌(×ボルテックス)した後、氷上のPCRTubeに分注する（25µlずつ
- ガスバーナーの火下で、ⅰ)爪楊枝で番号を振ったコロニー(番号は①から)をつつき、ⅱ)PCRTubeに突っ込み、ⅲ)マスタープレートの対応した番号の場所に刺す。（この3つ作業は同じ爪楊枝で行う）
- 5の作業をコロニーの数繰り返す。
- すべてのコロニー分のPCRTubeを作り終えたらThermal cyclerにセットし、RUNする。
- 反応終了後、電気泳動にて結果を観察 or 4℃で保存。
Making Medium for Culture
- Erlenmeyer flask
- Graduated cylinder
- Test Tube or Plate
- Autoclave
- Stirrer
- Electronic balance
- Burner or Clean bench
- Yeast Extract
- Peptone
- NaCl
- Antibiotic
- Agar
- 電子天秤で目的培地の材料の量を測りとる。
- 測り取った試薬にDWを目的量の9割程度加え、よく撹拌し溶解する。
- DWで目的量までメスアップする（メスシリンダーを使う必要なし)
- 試験管に10mlずつ分注し、121℃で15minオートクレーブにかける。
- オートクレーブ後、抗生物質を入れる場合、培地を50～60℃に冷ましてから、無菌条件(バーナーの火下約30cm以内or Clean bench内)で指定濃度になるように加える。
- 無菌状態(バーナーの火下約30cm以内or Clean bench内)で培地をプレートに分注し、冷まして固まらせる。
- 無菌条件下で蓋をあけ、十分に乾燥させた後に4℃で保存する。
Making Gel for Electrophoresis
- Erlenmeyer flask
- Graduated cylinder
- Type of gel
- Microwave oven
- Electronic balance
- Agarose
- TAE Buffer
- EtBr Solution
- TAE Bufferに任意の濃度（0.8～1.5％）になるようにAgaroseを加え、混ぜる。
- レンジで加熱し、Agaroseを完全に溶解させる。
- 50～60℃に冷まし、終濃度5µg/mlになるようにEtBr溶液を加える。
- 型に流し込み、コームを刺し、固める。小さいウェル（10µl用）はPCRなどの確認用、大きいウェル（20µl用）はDNAのゲル抽出用（目的のバンドの分離用）である。
- コームを抜き、使用 or 保存する。
