Team:Tokyo Metropolitan/Notebook

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Contents

Lab Notebook

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Octorber
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Lab Protocols

PCR (PrimeSTAR® HS DNA Polymerase)

  • Ice
  • Micro pipette**Thermal cycler
  • PCR Tube
  • Micro Tube
  • DW
  • 5× PCR Buffer
  • dNTP　(2.5mM)
  • Primer(Forward & Reverse)　 (20µM)
  • Template DNA
  • PrimeSTAR® HS DNA Polymerase　(2.5U/μl)


  1. Add the all following components on ice.
  2. Mix thoroughly. Add

Electrophoresis

  • Gel
  • 泳動槽
  • Parafilm
  • Micro pipette
  • TAE Buffer
  • 6× Loading Buffer
  • DW
  • 5× PCR Buffer


  1. Set gel in a gel tank. Pour the TAE Buffer into the gel tank.
    • Loading Buffer
    • DNA solution
    • DW
  2. Mix these components on a Parafilm by pipetting.
  3. Pour the mixture sample into well.
  4. Switch on the power-source and run the gel at 100V for 20min.
  5. Observe the band by exposing ultraviolet radiation

Ethanol precipitation

  • Centrifuge
  • Micro Tube
  • Micro pipette
  • Aspirator
  • 99.5％Ethanol
  • 3.0M Sodium acetate (pH5.2)
  • TE Buffer
  1. Add 0.1 volume 3M Sodium acetate to the nucleic acid sample and vortex.
  2. Add 4 µl of Dr. GenTLETM Precipitation Carrier and vortex.
  3. Add 2.5 volumes of ethanol and vortex.
  4. Centrifuge at 12,000 rpm at 4˚C for 15 min.
  5. Discard the supernatant.
  6. Rinse the pellet with 70% ethanol and centrifuge again at 12,000 rpm at 4˚C for 5 min.
  7. Discard the supernatant and dry.
  8. Dissolve the pellet in sterilized water or TE buffer.

Plasmid Extraction

  • Ice
  • Micro Tube
  • Micro pipette
  • Centrifuge
  • 50ｍM glucose ; 10mM EDTA ; 25ml Tris-HCl (pH 8.0)
  • 5N NaOH
  • 10％ SDS
  • 3M Potassium Acetate (pH 4.8)


  1. 菌の前培養液を遠心(12000rpm,5min)し、上清を捨てる。
  2. 沈殿を50ｍM glucose; 10mM EDTA; 25mM Tris-HCl (pH 8.0) 100μlで再懸濁する。
  3. 0.2N NaOH; 1％ SDS（用時調整）200μlを加え混合し、氷上で5minインキュベートする。
  4. 3M Potassium Acetate (pH 4.8) 150μl を加えよく混合し、氷上5minインキュベートする。
  5. 遠心(12000rpm,5min)し、遠心後上清を回収する。

Digestion

  • Micro Tube
  • Micro pipette
  • Heat Block　or Water bus
  • Digest Enzyme
  • 10×Buffer　
  • DW


  1. Tubeに加え、混合する.
  2. 37℃でインキュベートする（2～16ｈ）

Ligation

  • Micro Tube
  • Micro pipette
  • Heat Block
  • T4 Ligase
  • 10× Buffer　
  • DW


  1. Tubeに加え、混合する.
  2. 16℃でインキュベートする（30min～1ｈ）

Transformation

  • Micro pipette
  • Heat Block　or Water bus
  • ECOS™ Competent E. coli
  • Plate (Antibiotic)
  • Spreader


  1. 氷上でコンピテントセルを融解する。
  2. 4℃または氷上で冷却したプラスミド溶液またはライゲーション溶液(コンピテントセルの5％以下)を加える。
  3. 直ちにボルテックスで 1秒間撹拌する。
  4. 氷上で 5minインキュベートする。
  5. 直ちに 42℃で 45 secインキュベートする。
  6. 氷上で 2minインキュベートする。
  7. あらかじめ37℃で保温しておいた Hi-Competence Broth またはSOC培地を、コンピテントセルの 4倍量程度加え、37℃で30minインキュベートする（この作業はアンピシリン使用時省く）
  8. 100 µl～全量を LB Plateに移し均一に塗布する。
  9. 37℃で 12～16hインキュベートする.

Colony PCR(Takara EX® Taq)

  • Plate
  • Ice
  • Micro pipette
  • Thermal cycler
  • Burner
  • 70％EtOH
  • Toothpick (爪楊枝)
  • PCRTube
  • Micro Tube
  • Spreader
  • DW
  • 10× PCR Buffer
  • dNTP (2.5mM)
  • primer(Forward & Reverse)　(20µM)
  • Taq Polymerase


  1. 培養し、プレートに形成されたコロニーに番号を振る。（数が多い際は、他のコロニーと距離が離れている、コロニーが大きい等の基準から48のコロニーをピックアップする）
  2. 何も生やしていない抗生物質入りの培地の裏に、１で振った番号を等間隔に書きこむ。（このプレートをマスタープレートという）
  3. コロニーの数分、以下の組成でDW→Buffer→dNTP→primer→polymeraseの順に混ぜていく。調製は氷上で行う。
  4. 良く撹拌(×ボルテックス)した後、氷上のPCRTubeに分注する（25µlずつ
  5. ガスバーナーの火下で、ⅰ)爪楊枝で番号を振ったコロニー(番号は①から)をつつき、ⅱ)PCRTubeに突っ込み、ⅲ)マスタープレートの対応した番号の場所に刺す。（この3つ作業は同じ爪楊枝で行う）
  6. 5の作業をコロニーの数繰り返す。
  7. すべてのコロニー分のPCRTubeを作り終えたらThermal cyclerにセットし、RUNする。
  8. 反応終了後、電気泳動にて結果を観察 or 4℃で保存。

Making Medium for Culture

  • Erlenmeyer flask
  • Graduated cylinder
  • Test Tube or Plate
  • Autoclave
  • Stirrer
  • Electronic balance
  • Burner or Clean bench
  • Yeast Extract
  • Peptone
  • NaCl
  • Antibiotic
  • Agar


  1. 電子天秤で目的培地の材料の量を測りとる。
  2. 測り取った試薬にDWを目的量の9割程度加え、よく撹拌し溶解する。
  3. DWで目的量までメスアップする（メスシリンダーを使う必要なし)
  4. 試験管に10mlずつ分注し、121℃で15minオートクレーブにかける。
  5. オートクレーブ後、抗生物質を入れる場合、培地を50～60℃に冷ましてから、無菌条件(バーナーの火下約30cm以内or　Clean bench内)で指定濃度になるように加える。
  6. 無菌状態(バーナーの火下約30cm以内or　Clean bench内)で培地をプレートに分注し、冷まして固まらせる。
  7. 無菌条件下で蓋をあけ、十分に乾燥させた後に4℃で保存する。

Making Gel for Electrophoresis

  • Erlenmeyer flask
  • Graduated cylinder
  • Type of gel
  • Microwave oven
  • Electronic balance
  • Agarose
  • TAE Buffer
  • EtBr Solution


  1. TAE Bufferに任意の濃度（0.8～1.5％）になるようにAgaroseを加え、混ぜる。
  2. レンジで加熱し、Agaroseを完全に溶解させる。
  3. 50～60℃に冷まし、終濃度5µg/mlになるようにEtBr溶液を加える。
  4. 型に流し込み、コームを刺し、固める。小さいウェル（10µl用）はPCRなどの確認用、大きいウェル（20µl用）はDNAのゲル抽出用（目的のバンドの分離用）である。
  5. コームを抜き、使用 or 保存する。
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