Team:Tokyo Metropolitan/Notebook

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Contents

Lab Notebook

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Octorber
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Lab Protocols

PCR (PrimeSTAR® HS DNA Polymerase)

  • Ice
  • Micro pipette**Thermal cycler
  • PCR Tube
  • Micro Tube
  • DW
  • 5× PCR Buffer
  • dNTP (2.5mM)
  • Primer(Forward & Reverse)  (20µM)
  • Template DNA
  • PrimeSTAR® HS DNA Polymerase (2.5U/μl)


  1. 以下の組成で、DW→Buffer→dNTP→primer→Template DNA→polymeraseの順に混ぜていく。反応液の調製は氷上で行う。Template DNAが液体の場合、その分DWの量を減らす。
  2. 良く撹拌(×ボルテックス)した後、氷上のPCR Tubeに分注する(50µlずつ)
  3. Thermal cyclerにセットし、RUNする。
    • 98℃・・・10sec
    • 55℃・・・5 or 15sec
    • 72℃・・・1min×1kbpごと 30cycle
  4. 反応終了後、電気泳動にて結果を観察 or 4℃で保存。

Electrophoresis

  • Gel
  • 泳動槽
  • Parafilm
  • Micro pipette
  • TAE Buffer
  • 6× Loading Buffer
  • DW
  • 5× PCR Buffer


  1. 泳動槽にゲルをセットし、TAE Bufferをゲルが浸るまで入れる。
    • Loading Buffer・・・1µl
    • DNA solution・・・5µl
    • DW・・・5µlをParafilmの上で、ピペッティングにより混ぜ、ゲルのウェルに入れる。
  2. 電流を流し、泳動する。(100V:通常のとき、50V:ゆっくりと丁寧に流したいとき)
  3. 紫外光をあてバンドを確認する。

Ethanol precipitation

  • Centrifuge
  • Micro Tube
  • Micro pipette
  • Aspirator
  • 99.5%Ethanol
  • 3.0M Sodium acetate (pH5.2)
  • TE Buffer


  1. 核酸(DNAまたはRNA)溶液に1/10量の3.0M Sodium acetateを加え混合する。
  2. 溶液100µlあたり1µl(溶液が400µl以下の時は4µl)のGenとるくんエタ沈キャリアーを加え混合する。
  3. 2.5倍量のEthanolを加え十分混合し、遠心(12000rpm,15min,4℃,)する。
  4. 遠心後、上清を除き、70%Ethanolを加え(3の総量と同量)混合し、遠心(12000rpm,5min,4℃,)する。=洗い
  5. 遠心後、上清を除き、乾燥する。
  6. 適当量のDWまたは TE Bufferを加え、沈殿を再溶解する。

Plasmid Extraction

  • Ice
  • Micro Tube
  • Micro pipette
  • Centrifuge
  • 50mM glucose ; 10mM EDTA ; 25ml Tris-HCl (pH 8.0)
  • 5N NaOH
  • 10% SDS
  • 3M Potassium Acetate (pH 4.8)


  1. 菌の前培養液を遠心(12000rpm,5min)し、上清を捨てる。
  2. 沈殿を50mM glucose; 10mM EDTA; 25mM Tris-HCl (pH 8.0) 100μlで再懸濁する。
  3. 0.2N NaOH; 1% SDS(用時調整)200μlを加え混合し、氷上で5minインキュベートする。
  4. 3M Potassium Acetate (pH 4.8) 150μl を加えよく混合し、氷上5minインキュベートする。
  5. 遠心(12000rpm,5min)し、遠心後上清を回収する。

Digestion

  • Micro Tube
  • Micro pipette
  • Heat Block or Water bus
  • Digest Enzyme
  • 10×Buffer 
  • DW


  1. Tubeに加え、混合する.
  2. 37℃でインキュベートする(2~16h)

Ligation

  • Micro Tube
  • Micro pipette
  • Heat Block
  • T4 Ligase
  • 10× Buffer 
  • DW


  1. Tubeに加え、混合する.
  2. 16℃でインキュベートする(30min~1h)

Transformation

  • Micro pipette
  • Heat Block or Water bus
  • ECOS™ Competent E. coli
  • Plate (Antibiotic)
  • Spreader


  1. 氷上でコンピテントセルを融解する。
  2. 4℃または氷上で冷却したプラスミド溶液またはライゲーション溶液(コンピテントセルの5%以下)を加える。
  3. 直ちにボルテックスで 1秒間撹拌する。
  4. 氷上で 5minインキュベートする。
  5. 直ちに 42℃で 45 secインキュベートする。
  6. 氷上で 2minインキュベートする。
  7. あらかじめ37℃で保温しておいた Hi-Competence Broth またはSOC培地を、コンピテントセルの 4倍量程度加え、37℃で30minインキュベートする(この作業はアンピシリン使用時省く)
  8. 100 µl~全量を LB Plateに移し均一に塗布する。
  9. 37℃で 12~16hインキュベートする.

Colony PCR(Takara EX® Taq)

  • Plate
  • Ice
  • Micro pipette
  • Thermal cycler
  • Burner
  • 70%EtOH
  • Toothpick (爪楊枝)
  • PCRTube
  • Micro Tube
  • Spreader
  • DW
  • 10× PCR Buffer
  • dNTP (2.5mM)
  • primer(Forward & Reverse) (20µM)
  • Taq Polymerase


  1. 培養し、プレートに形成されたコロニーに番号を振る。(数が多い際は、他のコロニーと距離が離れている、コロニーが大きい等の基準から48のコロニーをピックアップする)
  2. 何も生やしていない抗生物質入りの培地の裏に、1で振った番号を等間隔に書きこむ。(このプレートをマスタープレートという)
  3. コロニーの数分、以下の組成でDW→Buffer→dNTP→primer→polymeraseの順に混ぜていく。調製は氷上で行う。
  4. 良く撹拌(×ボルテックス)した後、氷上のPCRTubeに分注する(25µlずつ
  5. ガスバーナーの火下で、ⅰ)爪楊枝で番号を振ったコロニー(番号は①から)をつつき、ⅱ)PCRTubeに突っ込み、ⅲ)マスタープレートの対応した番号の場所に刺す。(この3つ作業は同じ爪楊枝で行う)
  6. 5の作業をコロニーの数繰り返す。
  7. すべてのコロニー分のPCRTubeを作り終えたらThermal cyclerにセットし、RUNする。
  8. 反応終了後、電気泳動にて結果を観察 or 4℃で保存。

Making Medium for Culture

  • Erlenmeyer flask
  • Graduated cylinder
  • Test Tube or Plate
  • Autoclave
  • Stirrer
  • Electronic balance
  • Burner or Clean bench
  • Yeast Extract
  • Peptone
  • NaCl
  • Antibiotic
  • Agar


  1. 電子天秤で目的培地の材料の量を測りとる。
  2. 測り取った試薬にDWを目的量の9割程度加え、よく撹拌し溶解する。
  3. DWで目的量までメスアップする(メスシリンダーを使う必要なし)
  4. 試験管に10mlずつ分注し、121℃で15minオートクレーブにかける。
  5. オートクレーブ後、抗生物質を入れる場合、培地を50~60℃に冷ましてから、無菌条件(バーナーの火下約30cm以内or Clean bench内)で指定濃度になるように加える。
  6. 無菌状態(バーナーの火下約30cm以内or Clean bench内)で培地をプレートに分注し、冷まして固まらせる。
  7. 無菌条件下で蓋をあけ、十分に乾燥させた後に4℃で保存する。

Making Gel for Electrophoresis

  • Erlenmeyer flask
  • Graduated cylinder
  • Type of gel
  • Microwave oven
  • Electronic balance
  • Agarose
  • TAE Buffer
  • EtBr Solution


  1. TAE Bufferに任意の濃度(0.8~1.5%)になるようにAgaroseを加え、混ぜる。
  2. レンジで加熱し、Agaroseを完全に溶解させる。
  3. 50~60℃に冷まし、終濃度5µg/mlになるようにEtBr溶液を加える。
  4. 型に流し込み、コームを刺し、固める。小さいウェル(10µl用)はPCRなどの確認用、大きいウェル(20µl用)はDNAのゲル抽出用(目的のバンドの分離用)である。
  5. コームを抜き、使用 or 保存する。