Team:Tokyo Metropolitan/Notebook

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(→Digestion)
(→Electrophoresis)
 
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==PCR (PrimeSTAR® HS DNA Polymerase)==
==PCR (PrimeSTAR® HS DNA Polymerase)==
*Ice
*Ice
-
*Micro pipette**Thermal cycler  
+
*Micro pipette
 +
*Thermal cycler  
*PCR Tube
*PCR Tube
*Micro Tube
*Micro Tube
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-
#Add the all following components on ice.
+
#Add following components on ice.
-
#Mix thoroughly. Add
+
#*DW
 +
#*5× PCR Buffer
 +
#*dNTP　(2.5mM)
 +
#*Primer(Forward & Reverse)　 (20µM)
 +
#*Template DNA
 +
#*PrimeSTAR® HS DNA Polymerase　(2.5U/μl)
 +
#Dispense PCR solution to PCR tubes.
 +
#Set PCR tubes on thermal cycler
 +
#Run PCR
 +
 
==Electrophoresis==
==Electrophoresis==
*Gel
*Gel
-
*泳動槽
+
*Electrophoresis bath
*Parafilm
*Parafilm
*Micro pipette
*Micro pipette
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*6× Loading Buffer
*6× Loading Buffer
*DW
*DW
-
*5× PCR Buffer
 
Line 251: Line 260:
#Discard the supernatant and dry.
#Discard the supernatant and dry.
#Dissolve the pellet in sterilized water or TE buffer.
#Dissolve the pellet in sterilized water or TE buffer.
 +
==Plasmid Extraction==
==Plasmid Extraction==
Line 257: Line 267:
*Micro pipette
*Micro pipette
*Centrifuge
*Centrifuge
-
*50ｍM glucose ; 10mM EDTA ; 25ml Tris-HCl (pH 8.0)
+
*50mM glucose ; 10mM EDTA ; 25ml Tris-HCl (pH 8.0)
*5N NaOH  
*5N NaOH  
*10％ SDS
*10％ SDS
Line 268: Line 278:
#Add 150µl of 3M Potassium Acetate (pH 4.8, 5M Acetic acid; 3M Potassium), and mix it. Incubate #on ice for 5min.
#Add 150µl of 3M Potassium Acetate (pH 4.8, 5M Acetic acid; 3M Potassium), and mix it. Incubate #on ice for 5min.
#Centrifuge on 12,000 rpm for 5min.
#Centrifuge on 12,000 rpm for 5min.
-
#Take supernatant.
+
#Take supernatant into Microtube.
 +
 
==Digestion==
==Digestion==
Line 284: Line 295:
#*10× Buffer   
#*10× Buffer   
#*Digest enzyme
#*Digest enzyme
-
#Incubate at 37°C. from 2h to 16h
+
#Incubate at 37°C, from 2h to 16h
 +
 
==Ligation==
==Ligation==
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#*T4 Ligase     
#*T4 Ligase     
#Incubate at 16°C, from 30min to 1h
#Incubate at 16°C, from 30min to 1h
 +
==Transformation==
==Transformation==
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 +
#Keep competent cells on ice to thaw it.
 +
#Add plasmid DNA into E.coli cells.
 +
#Incubate on ice for 5 min.
 +
#Put tubes into water bath at 42℃ for 45 seconds.
 +
#Put tubes back on ice for 2 minutes.
 +
#Add four times volume of LB (with no antibiotic added). Incubate tubes for 30 min at 37℃.
 +
#Spread about 100 ul of the resulting culture on LB plates
 +
#Incubate overnight.
-
#氷上でコンピテントセルを融解する。
 
-
#4℃または氷上で冷却したプラスミド溶液またはライゲーション溶液(コンピテントセルの5％以下)を加える。
 
-
#直ちにボルテックスで 1秒間撹拌する。
 
-
#氷上で 5minインキュベートする。
 
-
#直ちに 42℃で 45 secインキュベートする。
 
-
#氷上で 2minインキュベートする。
 
-
#あらかじめ37℃で保温しておいた Hi-Competence Broth またはSOC培地を、コンピテントセルの 4倍量程度加え、37℃で30minインキュベートする（この作業はアンピシリン使用時省く）
 
-
#100 µl～全量を LB Plateに移し均一に塗布する。
 
-
#37℃で 12～16hインキュベートする.
 
==Colony PCR(Takara EX® Taq)==
==Colony PCR(Takara EX® Taq)==
Line 329: Line 341:
*Burner
*Burner
*70％EtOH
*70％EtOH
-
*Toothpick (爪楊枝)
+
*Toothpick  
*PCRTube
*PCRTube
*Micro Tube
*Micro Tube
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 +
#Add the all following components on ice.
 +
#*DW
 +
#*10× PCR Buffer
 +
#*dNTP　(2.5mM)
 +
#*Primer(Forward & Reverse)　 (20µM)
 +
#*Template DNA
 +
#*Taq Polymerase
 +
#Dispense PCR solution to PCR tubes.
 +
#Pick up a colony and put it into PCR tube.then inoculate to master plate.
 +
#Set PCR tubes on thermal cycler
 +
#Run PCR
-
#培養し、プレートに形成されたコロニーに番号を振る。（数が多い際は、他のコロニーと距離が離れている、コロニーが大きい等の基準から48のコロニーをピックアップする）
 
-
#何も生やしていない抗生物質入りの培地の裏に、１で振った番号を等間隔に書きこむ。（このプレートをマスタープレートという）
 
-
#コロニーの数分、以下の組成でDW→Buffer→dNTP→primer→polymeraseの順に混ぜていく。調製は氷上で行う。
 
-
#良く撹拌(×ボルテックス)した後、氷上のPCRTubeに分注する（25µlずつ
 
-
#ガスバーナーの火下で、ⅰ)爪楊枝で番号を振ったコロニー(番号は①から)をつつき、ⅱ)PCRTubeに突っ込み、ⅲ)マスタープレートの対応した番号の場所に刺す。（この3つ作業は同じ爪楊枝で行う）
 
-
#5の作業をコロニーの数繰り返す。
 
-
#すべてのコロニー分のPCRTubeを作り終えたらThermal cyclerにセットし、RUNする。
 
-
#反応終了後、電気泳動にて結果を観察 or 4℃で保存。
 
==Making Medium for Culture==
==Making Medium for Culture==
Line 365: Line 380:
-
#電子天秤で目的培地の材料の量を測りとる。
+
#Measure component of medium and mix them in Erlenmeyer flask.
-
#測り取った試薬にDWを目的量の9割程度加え、よく撹拌し溶解する。
+
#Autoclave(121℃,20min).
-
#DWで目的量までメスアップする（メスシリンダーを使う必要なし)
+
#(Add appropriate antibiotics)
-
#試験管に10mlずつ分注し、121℃で15minオートクレーブにかける。
+
#Dispense medium to test tube or plate.
-
#オートクレーブ後、抗生物質を入れる場合、培地を50～60℃に冷ましてから、無菌条件(バーナーの火下約30cm以内or　Clean bench内)で指定濃度になるように加える。
+
#Store at 4℃
-
#無菌状態(バーナーの火下約30cm以内or　Clean bench内)で培地をプレートに分注し、冷まして固まらせる。
+
-
#無菌条件下で蓋をあけ、十分に乾燥させた後に4℃で保存する。
+
-
 
+
-
==Making Gel for Electrophoresis==
+
-
*Erlenmeyer flask
+
-
*Graduated cylinder
+
-
*Type of gel
+
-
*Microwave oven
+
-
*Electronic balance
+
-
*Agarose
+
-
*TAE Buffer
+
-
*EtBr Solution
+
-
 
+
-
 
+
-
#TAE Bufferに任意の濃度（0.8～1.5％）になるようにAgaroseを加え、混ぜる。
+
-
#レンジで加熱し、Agaroseを完全に溶解させる。
+
-
#50～60℃に冷まし、終濃度5µg/mlになるようにEtBr溶液を加える。
+
-
#型に流し込み、コームを刺し、固める。小さいウェル（10µl用）はPCRなどの確認用、大きいウェル（20µl用）はDNAのゲル抽出用（目的のバンドの分離用）である。
+
-
#コームを抜き、使用 or 保存する。
+

Latest revision as of 17:17, 4 October 2011

Tokyo Metropolitan Labnotes.png

Contents

Lab Notebook

Augast
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September
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Octorber
Sun Mon Tue Wed Thu Fri Sat
1
2 3 4 5 6

Lab Protocols

PCR (PrimeSTAR® HS DNA Polymerase)

  • Ice
  • Micro pipette
  • Thermal cycler
  • PCR Tube
  • Micro Tube
  • DW
  • 5× PCR Buffer
  • dNTP　(2.5mM)
  • Primer(Forward & Reverse)　 (20µM)
  • Template DNA
  • PrimeSTAR® HS DNA Polymerase　(2.5U/μl)


  1. Add following components on ice.
    • DW
    • 5× PCR Buffer
    • dNTP　(2.5mM)
    • Primer(Forward & Reverse)　 (20µM)
    • Template DNA
    • PrimeSTAR® HS DNA Polymerase　(2.5U/μl)
  2. Dispense PCR solution to PCR tubes.
  3. Set PCR tubes on thermal cycler
  4. Run PCR


Electrophoresis

  • Gel
  • Electrophoresis bath
  • Parafilm
  • Micro pipette
  • TAE Buffer
  • 6× Loading Buffer
  • DW


  1. Set gel in a gel tank. Pour the TAE Buffer into the gel tank.
    • Loading Buffer
    • DNA solution
    • DW
  2. Mix these components on a Parafilm by pipetting.
  3. Pour the mixture sample into well.
  4. Switch on the power-source and run the gel at 100V for 20min.
  5. Observe the band by exposing ultraviolet radiation

Ethanol precipitation

  • Centrifuge
  • Micro Tube
  • Micro pipette
  • Aspirator
  • 99.5％Ethanol
  • 3.0M Sodium acetate (pH5.2)
  • TE Buffer


  1. Add 0.1 volume 3M Sodium acetate to the nucleic acid sample and vortex.
  2. Add 4 µl of Dr. GenTLETM Precipitation Carrier and vortex.
  3. Add 2.5 volumes of ethanol and vortex.
  4. Centrifuge at 12,000 rpm at 4˚C for 15 min.
  5. Discard the supernatant.
  6. Rinse the pellet with 70% ethanol and centrifuge again at 12,000 rpm at 4˚C for 5 min.
  7. Discard the supernatant and dry.
  8. Dissolve the pellet in sterilized water or TE buffer.


Plasmid Extraction

  • Ice
  • Micro Tube
  • Micro pipette
  • Centrifuge
  • 50mM glucose ; 10mM EDTA ; 25ml Tris-HCl (pH 8.0)
  • 5N NaOH
  • 10％ SDS
  • 3M Potassium Acetate (pH 4.8)


  1. Centrifuge the E-coli pre-culture on 12,000 rpm for 5min, and then discard the supernatant.
  2. Add 100µl of the solution (50ｍM glucose; 10mM EDTA; 25ml Tris-HCl(pH 8.0)), and mix it gently
  3. Add 200µl of the 0.2N NaOH; 1％ SDS, and mix it. Incubate on ice for 5min.
  4. Add 150µl of 3M Potassium Acetate (pH 4.8, 5M Acetic acid; 3M Potassium), and mix it. Incubate #on ice for 5min.
  5. Centrifuge on 12,000 rpm for 5min.
  6. Take supernatant into Microtube.


Digestion

  • Micro Tube
  • Micro pipette
  • Heat Block　or Water bus
  • Digest Enzyme
  • 10×Buffer　
  • DW


  1. Add below components into a tube and mix them.
    • DNA solution
    • DW
    • 10× Buffer
    • Digest enzyme
  2. Incubate at 37°C, from 2h to 16h


Ligation

  • Micro Tube
  • Micro pipette
  • Heat Block
  • T4 Ligase
  • 10× Buffer　
  • DW


  1. Add below components into a tube and mix them.
    • DNA solution 1
    • DNA solution 2　　　
    • DW
    • 10× Buffer
    • T4 Ligase
  2. Incubate at 16°C, from 30min to 1h


Transformation

  • Micro pipette
  • Heat Block　or Water bus
  • ECOS™ Competent E. coli
  • Plate (Antibiotic)
  • Spreader


  1. Keep competent cells on ice to thaw it.
  2. Add plasmid DNA into E.coli cells.
  3. Incubate on ice for 5 min.
  4. Put tubes into water bath at 42℃ for 45 seconds.
  5. Put tubes back on ice for 2 minutes.
  6. Add four times volume of LB (with no antibiotic added). Incubate tubes for 30 min at 37℃.
  7. Spread about 100 ul of the resulting culture on LB plates
  8. Incubate overnight.


Colony PCR(Takara EX® Taq)

  • Plate
  • Ice
  • Micro pipette
  • Thermal cycler
  • Burner
  • 70％EtOH
  • Toothpick
  • PCRTube
  • Micro Tube
  • Spreader
  • DW
  • 10× PCR Buffer
  • dNTP (2.5mM)
  • primer(Forward & Reverse)　(20µM)
  • Taq Polymerase


  1. Add the all following components on ice.
    • DW
    • 10× PCR Buffer
    • dNTP　(2.5mM)
    • Primer(Forward & Reverse)　 (20µM)
    • Template DNA
    • Taq Polymerase
  2. Dispense PCR solution to PCR tubes.
  3. Pick up a colony and put it into PCR tube.then inoculate to master plate.
  4. Set PCR tubes on thermal cycler
  5. Run PCR


Making Medium for Culture

  • Erlenmeyer flask
  • Graduated cylinder
  • Test Tube or Plate
  • Autoclave
  • Stirrer
  • Electronic balance
  • Burner or Clean bench
  • Yeast Extract
  • Peptone
  • NaCl
  • Antibiotic
  • Agar


  1. Measure component of medium and mix them in Erlenmeyer flask.
  2. Autoclave(121℃,20min).
  3. (Add appropriate antibiotics)
  4. Dispense medium to test tube or plate.
  5. Store at 4℃
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