Team:Tokyo Metropolitan/Notebook

From 2011.igem.org

(Difference between revisions)
(Electrophoresis)
 
(32 intermediate revisions not shown)
Line 4: Line 4:
</html>
</html>
-
 
+
[[image:Tokyo_Metropolitan_Labnotes.png|right]]
=Lab Notebook=
=Lab Notebook=
 +
<html>
 +
<div align="center">
 +
<table><tr valign="top"><td width="300">
-
<html>
 
-
<table><tr><td>
 
-
<!-- ここから八月のカレンダー --!>
 
<table>
<table>
Line 80: Line 80:
</table>
</table>
-
<!-- ここまで八月のカレンダー --!>
+
 
-
</td><td>
+
</td><td width="300">
-
<!-- ここから9月のカレンダー --!>
+
 
<table>
<table>
Line 151: Line 151:
</tr>
</tr>
</table>
</table>
-
<!-- ここまで9月のカレンダー --!>
+
 
-
</td><td>
+
</td><td width="300">
-
<!-- ここから10月のカレンダー --!>
+
 
<table>
<table>
Line 191: Line 191:
</tr>
</tr>
</table>
</table>
-
<!-- ここまで10月のカレンダー --!>
 
-
</td></tr></table>
+
 
 +
</td></tr></table></div>
</html>
</html>
-
 
=Lab Protocols=
=Lab Protocols=
==PCR (PrimeSTAR® HS DNA Polymerase)==
==PCR (PrimeSTAR® HS DNA Polymerase)==
*Ice
*Ice
-
*Micro pipette**Thermal cycler  
+
*Micro pipette
 +
*Thermal cycler  
*PCR Tube
*PCR Tube
*Micro Tube
*Micro Tube
Line 211: Line 211:
-
#以下の組成で、DW→Buffer→dNTP→primer→Template DNA→polymeraseの順に混ぜていく。反応液の調製は氷上で行う。Template DNAが液体の場合、その分DWの量を減らす。
+
#Add following components on ice.
-
#良く撹拌(×ボルテックス)した後、氷上のPCR Tubeに分注する(50µlずつ)
+
#*DW
-
#Thermal cyclerにセットし、RUNする。
+
#*5× PCR Buffer
-
#*98℃・・・10sec
+
#*dNTP (2.5mM)
-
#*55℃・・・5 or 15sec
+
#*Primer(Forward & Reverse)  (20µM)
-
#*72℃・・・1min×1kbpごと 30cycle
+
#*Template DNA
-
#反応終了後、電気泳動にて結果を観察 or 4℃で保存。
+
#*PrimeSTAR® HS DNA Polymerase (2.5U/μl)
 +
#Dispense PCR solution to PCR tubes.
 +
#Set PCR tubes on thermal cycler
 +
#Run PCR
 +
 
==Electrophoresis==
==Electrophoresis==
*Gel
*Gel
-
*泳動槽
+
*Electrophoresis bath
*Parafilm
*Parafilm
*Micro pipette
*Micro pipette
Line 227: Line 231:
*6× Loading Buffer
*6× Loading Buffer
*DW
*DW
-
*5× PCR Buffer
 
-
#泳動槽にゲルをセットし、TAE Bufferをゲルが浸るまで入れる。
+
#Set gel in a gel tank. Pour the TAE Buffer into the gel tank.
-
#*Loading Buffer・・・1µl
+
#*Loading Buffer
-
#*DNA solution・・・5µl
+
#*DNA solution
-
#*DW・・・5µlをParafilmの上で、ピペッティングにより混ぜ、ゲルのウェルに入れる。
+
#*DW
-
#電流を流し、泳動する。(100V:通常のとき、50V:ゆっくりと丁寧に流したいとき)
+
#Mix these components on a Parafilm by pipetting.
-
#紫外光をあてバンドを確認する。
+
#Pour the mixture sample into well.
 +
#Switch on the power-source and run the gel at 100V for 20min.
 +
#Observe the band by exposing ultraviolet radiation
==Ethanol precipitation==
==Ethanol precipitation==
Line 247: Line 252:
-
#核酸(DNAまたはRNA)溶液に1/10量の3.0M Sodium acetateを加え混合する。
+
#Add 0.1 volume 3M Sodium acetate to the nucleic acid sample and vortex.
-
#溶液100µlあたり1µl(溶液が400µl以下の時は4µl)のGenとるくんエタ沈キャリアーを加え混合する。
+
#Add 4 µl of Dr. GenTLETM Precipitation Carrier and vortex.
-
#2.5倍量のEthanolを加え十分混合し、遠心(12000rpm,15min,4℃,)する。
+
#Add 2.5 volumes of ethanol and vortex.
-
#遠心後、上清を除き、70%Ethanolを加え(3の総量と同量)混合し、遠心(12000rpm,5min,4℃,)する。=洗い
+
#Centrifuge at 12,000 rpm at 4˚C for 15 min.
-
#遠心後、上清を除き、乾燥する。
+
#Discard the supernatant.
-
#適当量のDWまたは TE Bufferを加え、沈殿を再溶解する。
+
#Rinse the pellet with 70% ethanol and centrifuge again at 12,000 rpm at 4˚C for 5 min.
 +
#Discard the supernatant and dry.
 +
#Dissolve the pellet in sterilized water or TE buffer.
 +
 
==Plasmid Extraction==
==Plasmid Extraction==
Line 259: Line 267:
*Micro pipette
*Micro pipette
*Centrifuge
*Centrifuge
-
*50mM glucose ; 10mM EDTA ; 25ml Tris-HCl (pH 8.0)
+
*50mM glucose ; 10mM EDTA ; 25ml Tris-HCl (pH 8.0)
*5N NaOH  
*5N NaOH  
*10% SDS
*10% SDS
Line 265: Line 273:
-
#菌の前培養液を遠心(12000rpm,5min)し、上清を捨てる。
+
#Centrifuge the E-coli pre-culture on 12,000 rpm for 5min, and then discard the supernatant.
-
#沈殿を50mM glucose; 10mM EDTA; 25mM Tris-HCl (pH 8.0) 100μlで再懸濁する。
+
#Add 100µl of the solution (50mM glucose; 10mM EDTA; 25ml Tris-HCl(pH 8.0)), and mix it gently
-
#0.2N NaOH; 1% SDS(用時調整)200μlを加え混合し、氷上で5minインキュベートする。
+
#Add 200µl of the 0.2N NaOH; 1% SDS, and mix it. Incubate on ice for 5min.
-
#3M Potassium Acetate (pH 4.8) 150μl を加えよく混合し、氷上5minインキュベートする。
+
#Add 150µl of 3M Potassium Acetate (pH 4.8, 5M Acetic acid; 3M Potassium), and mix it. Incubate #on ice for 5min.
-
#遠心(12000rpm,5min)し、遠心後上清を回収する。
+
#Centrifuge on 12,000 rpm for 5min.
 +
#Take supernatant into Microtube.
 +
 
==Digestion==
==Digestion==
Line 280: Line 290:
-
#Tubeに加え、混合する.
+
#Add below components into a tube and mix them.
-
#37℃でインキュベートする(2~16h)
+
#*DNA solution
 +
#*DW
 +
#*10× Buffer 
 +
#*Digest enzyme
 +
#Incubate at 37°C, from 2h to 16h
 +
 
==Ligation==
==Ligation==
Line 292: Line 307:
 +
#Add below components into a tube and mix them.
 +
#*DNA solution 1
 +
#*DNA solution 2   
 +
#*DW
 +
#*10× Buffer 
 +
#*T4 Ligase   
 +
#Incubate at 16°C, from 30min to 1h
-
#Tubeに加え、混合する.
 
-
#16℃でインキュベートする(30min~1h)
 
==Transformation==
==Transformation==
Line 304: Line 324:
 +
#Keep competent cells on ice to thaw it.
 +
#Add plasmid DNA into E.coli cells.
 +
#Incubate on ice for 5 min.
 +
#Put tubes into water bath at 42℃ for 45 seconds.
 +
#Put tubes back on ice for 2 minutes.
 +
#Add four times volume of LB (with no antibiotic added). Incubate tubes for 30 min at 37℃.
 +
#Spread about 100 ul of the resulting culture on LB plates
 +
#Incubate overnight.
-
#氷上でコンピテントセルを融解する。
 
-
#4℃または氷上で冷却したプラスミド溶液またはライゲーション溶液(コンピテントセルの5%以下)を加える。
 
-
#直ちにボルテックスで 1秒間撹拌する。
 
-
#氷上で 5minインキュベートする。
 
-
#直ちに 42℃で 45 secインキュベートする。
 
-
#氷上で 2minインキュベートする。
 
-
#あらかじめ37℃で保温しておいた Hi-Competence Broth またはSOC培地を、コンピテントセルの 4倍量程度加え、37℃で30minインキュベートする(この作業はアンピシリン使用時省く)
 
-
#100 µl~全量を LB Plateに移し均一に塗布する。
 
-
#37℃で 12~16hインキュベートする.
 
==Colony PCR(Takara EX® Taq)==
==Colony PCR(Takara EX® Taq)==
Line 322: Line 341:
*Burner
*Burner
*70%EtOH
*70%EtOH
-
*Toothpick (爪楊枝)
+
*Toothpick  
*PCRTube
*PCRTube
*Micro Tube
*Micro Tube
Line 333: Line 352:
 +
#Add the all following components on ice.
 +
#*DW
 +
#*10× PCR Buffer
 +
#*dNTP (2.5mM)
 +
#*Primer(Forward & Reverse)  (20µM)
 +
#*Template DNA
 +
#*Taq Polymerase
 +
#Dispense PCR solution to PCR tubes.
 +
#Pick up a colony and put it into PCR tube.then inoculate to master plate.
 +
#Set PCR tubes on thermal cycler
 +
#Run PCR
-
#培養し、プレートに形成されたコロニーに番号を振る。(数が多い際は、他のコロニーと距離が離れている、コロニーが大きい等の基準から48のコロニーをピックアップする)
 
-
#何も生やしていない抗生物質入りの培地の裏に、1で振った番号を等間隔に書きこむ。(このプレートをマスタープレートという)
 
-
#コロニーの数分、以下の組成でDW→Buffer→dNTP→primer→polymeraseの順に混ぜていく。調製は氷上で行う。
 
-
#良く撹拌(×ボルテックス)した後、氷上のPCRTubeに分注する(25µlずつ
 
-
#ガスバーナーの火下で、ⅰ)爪楊枝で番号を振ったコロニー(番号は①から)をつつき、ⅱ)PCRTubeに突っ込み、ⅲ)マスタープレートの対応した番号の場所に刺す。(この3つ作業は同じ爪楊枝で行う)
 
-
#5の作業をコロニーの数繰り返す。
 
-
#すべてのコロニー分のPCRTubeを作り終えたらThermal cyclerにセットし、RUNする。
 
-
#反応終了後、電気泳動にて結果を観察 or 4℃で保存。
 
==Making Medium for Culture==
==Making Medium for Culture==
Line 358: Line 380:
-
#電子天秤で目的培地の材料の量を測りとる。
+
#Measure component of medium and mix them in Erlenmeyer flask.
-
#測り取った試薬にDWを目的量の9割程度加え、よく撹拌し溶解する。
+
#Autoclave(121℃,20min).
-
#DWで目的量までメスアップする(メスシリンダーを使う必要なし)
+
#(Add appropriate antibiotics)
-
#試験管に10mlずつ分注し、121℃で15minオートクレーブにかける。
+
#Dispense medium to test tube or plate.
-
#オートクレーブ後、抗生物質を入れる場合、培地を50~60℃に冷ましてから、無菌条件(バーナーの火下約30cm以内or Clean bench内)で指定濃度になるように加える。
+
#Store at 4℃
-
#無菌状態(バーナーの火下約30cm以内or Clean bench内)で培地をプレートに分注し、冷まして固まらせる。
+
-
#無菌条件下で蓋をあけ、十分に乾燥させた後に4℃で保存する。
+
-
 
+
-
==Making Gel for Electrophoresis==
+
-
*Erlenmeyer flask
+
-
*Graduated cylinder
+
-
*Type of gel
+
-
*Microwave oven
+
-
*Electronic balance
+
-
*Agarose
+
-
*TAE Buffer
+
-
*EtBr Solution
+
-
 
+
-
 
+
-
#TAE Bufferに任意の濃度(0.8~1.5%)になるようにAgaroseを加え、混ぜる。
+
-
#レンジで加熱し、Agaroseを完全に溶解させる。
+
-
#50~60℃に冷まし、終濃度5µg/mlになるようにEtBr溶液を加える。
+
-
#型に流し込み、コームを刺し、固める。小さいウェル(10µl用)はPCRなどの確認用、大きいウェル(20µl用)はDNAのゲル抽出用(目的のバンドの分離用)である。
+
-
#コームを抜き、使用 or 保存する。
+

Latest revision as of 17:17, 4 October 2011

Tokyo Metropolitan Labnotes.png

Contents

Lab Notebook

Augast
Sun Mon Tue Wed Thu Fri Sat
1 2 3 4 5 6
7 8 9 10 11 12 13
14 15 16 17 18 19 20
21 22 23 24 25 26 27
28 29 30 31
September
Sun Mon Tue Wed Thu Fri Sat
1 2 3
4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15 16 17
18 19 20 21 22 23 24
25 26 27 28 29 30
Octorber
Sun Mon Tue Wed Thu Fri Sat
1
2 3 4 5 6

Lab Protocols

PCR (PrimeSTAR® HS DNA Polymerase)

  • Ice
  • Micro pipette
  • Thermal cycler
  • PCR Tube
  • Micro Tube
  • DW
  • 5× PCR Buffer
  • dNTP (2.5mM)
  • Primer(Forward & Reverse)  (20µM)
  • Template DNA
  • PrimeSTAR® HS DNA Polymerase (2.5U/μl)


  1. Add following components on ice.
    • DW
    • 5× PCR Buffer
    • dNTP (2.5mM)
    • Primer(Forward & Reverse)  (20µM)
    • Template DNA
    • PrimeSTAR® HS DNA Polymerase (2.5U/μl)
  2. Dispense PCR solution to PCR tubes.
  3. Set PCR tubes on thermal cycler
  4. Run PCR


Electrophoresis

  • Gel
  • Electrophoresis bath
  • Parafilm
  • Micro pipette
  • TAE Buffer
  • 6× Loading Buffer
  • DW


  1. Set gel in a gel tank. Pour the TAE Buffer into the gel tank.
    • Loading Buffer
    • DNA solution
    • DW
  2. Mix these components on a Parafilm by pipetting.
  3. Pour the mixture sample into well.
  4. Switch on the power-source and run the gel at 100V for 20min.
  5. Observe the band by exposing ultraviolet radiation

Ethanol precipitation

  • Centrifuge
  • Micro Tube
  • Micro pipette
  • Aspirator
  • 99.5%Ethanol
  • 3.0M Sodium acetate (pH5.2)
  • TE Buffer


  1. Add 0.1 volume 3M Sodium acetate to the nucleic acid sample and vortex.
  2. Add 4 µl of Dr. GenTLETM Precipitation Carrier and vortex.
  3. Add 2.5 volumes of ethanol and vortex.
  4. Centrifuge at 12,000 rpm at 4˚C for 15 min.
  5. Discard the supernatant.
  6. Rinse the pellet with 70% ethanol and centrifuge again at 12,000 rpm at 4˚C for 5 min.
  7. Discard the supernatant and dry.
  8. Dissolve the pellet in sterilized water or TE buffer.


Plasmid Extraction

  • Ice
  • Micro Tube
  • Micro pipette
  • Centrifuge
  • 50mM glucose ; 10mM EDTA ; 25ml Tris-HCl (pH 8.0)
  • 5N NaOH
  • 10% SDS
  • 3M Potassium Acetate (pH 4.8)


  1. Centrifuge the E-coli pre-culture on 12,000 rpm for 5min, and then discard the supernatant.
  2. Add 100µl of the solution (50mM glucose; 10mM EDTA; 25ml Tris-HCl(pH 8.0)), and mix it gently
  3. Add 200µl of the 0.2N NaOH; 1% SDS, and mix it. Incubate on ice for 5min.
  4. Add 150µl of 3M Potassium Acetate (pH 4.8, 5M Acetic acid; 3M Potassium), and mix it. Incubate #on ice for 5min.
  5. Centrifuge on 12,000 rpm for 5min.
  6. Take supernatant into Microtube.


Digestion

  • Micro Tube
  • Micro pipette
  • Heat Block or Water bus
  • Digest Enzyme
  • 10×Buffer 
  • DW


  1. Add below components into a tube and mix them.
    • DNA solution
    • DW
    • 10× Buffer
    • Digest enzyme
  2. Incubate at 37°C, from 2h to 16h


Ligation

  • Micro Tube
  • Micro pipette
  • Heat Block
  • T4 Ligase
  • 10× Buffer 
  • DW


  1. Add below components into a tube and mix them.
    • DNA solution 1
    • DNA solution 2   
    • DW
    • 10× Buffer
    • T4 Ligase
  2. Incubate at 16°C, from 30min to 1h


Transformation

  • Micro pipette
  • Heat Block or Water bus
  • ECOS™ Competent E. coli
  • Plate (Antibiotic)
  • Spreader


  1. Keep competent cells on ice to thaw it.
  2. Add plasmid DNA into E.coli cells.
  3. Incubate on ice for 5 min.
  4. Put tubes into water bath at 42℃ for 45 seconds.
  5. Put tubes back on ice for 2 minutes.
  6. Add four times volume of LB (with no antibiotic added). Incubate tubes for 30 min at 37℃.
  7. Spread about 100 ul of the resulting culture on LB plates
  8. Incubate overnight.


Colony PCR(Takara EX® Taq)

  • Plate
  • Ice
  • Micro pipette
  • Thermal cycler
  • Burner
  • 70%EtOH
  • Toothpick
  • PCRTube
  • Micro Tube
  • Spreader
  • DW
  • 10× PCR Buffer
  • dNTP (2.5mM)
  • primer(Forward & Reverse) (20µM)
  • Taq Polymerase


  1. Add the all following components on ice.
    • DW
    • 10× PCR Buffer
    • dNTP (2.5mM)
    • Primer(Forward & Reverse)  (20µM)
    • Template DNA
    • Taq Polymerase
  2. Dispense PCR solution to PCR tubes.
  3. Pick up a colony and put it into PCR tube.then inoculate to master plate.
  4. Set PCR tubes on thermal cycler
  5. Run PCR


Making Medium for Culture

  • Erlenmeyer flask
  • Graduated cylinder
  • Test Tube or Plate
  • Autoclave
  • Stirrer
  • Electronic balance
  • Burner or Clean bench
  • Yeast Extract
  • Peptone
  • NaCl
  • Antibiotic
  • Agar


  1. Measure component of medium and mix them in Erlenmeyer flask.
  2. Autoclave(121℃,20min).
  3. (Add appropriate antibiotics)
  4. Dispense medium to test tube or plate.
  5. Store at 4℃