Team:Tokyo Metropolitan/Notebook

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Contents

Lab Notebook

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Octorber
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Lab Protocols

PCR (PrimeSTAR® HS DNA Polymerase)

  • Ice
  • Micro pipette**Thermal cycler
  • PCR Tube
  • Micro Tube
  • DW
  • 5× PCR Buffer
  • dNTP　(2.5mM)
  • Primer(Forward & Reverse)　 (20µM)
  • Template DNA
  • PrimeSTAR® HS DNA Polymerase　(2.5U/μl)


  1. 以下の組成で、DW→Buffer→dNTP→primer→Template DNA→polymeraseの順に混ぜていく。反応液の調製は氷上で行う。Template DNAが液体の場合、その分DWの量を減らす。
  2. 良く撹拌(×ボルテックス)した後、氷上のPCR Tubeに分注する（50µlずつ）
  3. Thermal cyclerにセットし、RUNする。
    • 98℃・・・10sec
    • 55℃・・・5 or 15sec
    • 72℃・・・1min×1kbpごと 30cycle
  4. 反応終了後、電気泳動にて結果を観察 or 4℃で保存。

Electrophoresis

  • Gel
  • 泳動槽
  • Parafilm
  • Micro pipette
  • TAE Buffer
  • 6× Loading Buffer
  • DW
  • 5× PCR Buffer


  1. 泳動槽にゲルをセットし、TAE Bufferをゲルが浸るまで入れる。
    • Loading Buffer・・・1µl
    • DNA solution・・・5µl
    • DW・・・5µlをParafilmの上で、ピペッティングにより混ぜ、ゲルのウェルに入れる。
  2. 電流を流し、泳動する。（100V：通常のとき、50V：ゆっくりと丁寧に流したいとき）
  3. 紫外光をあてバンドを確認する。

Ethanol precipitation

  • Centrifuge
  • Micro Tube
  • Micro pipette
  • Aspirator
  • 99.5％Ethanol
  • 3.0M Sodium acetate (pH5.2)
  • TE Buffer


  1. 核酸（DNAまたはRNA）溶液に1/10量の3.0M Sodium acetateを加え混合する。
  2. 溶液100µlあたり1µl（溶液が400µl以下の時は4µl）のGenとるくんエタ沈キャリアーを加え混合する。
  3. 2.5倍量のEthanolを加え十分混合し、遠心(12000rpm,15min,4℃,)する。
  4. 遠心後、上清を除き、70%Ethanolを加え(3の総量と同量)混合し、遠心(12000rpm,5min,4℃,)する。＝洗い
  5. 遠心後、上清を除き、乾燥する。
  6. 適当量のDWまたは TE Bufferを加え、沈殿を再溶解する。

Plasmid Extraction

  • Ice
  • Micro Tube
  • Micro pipette
  • Centrifuge
  • 50ｍM glucose ; 10mM EDTA ; 25ml Tris-HCl (pH 8.0)
  • 5N NaOH
  • 10％ SDS
  • 3M Potassium Acetate (pH 4.8)


  1. 菌の前培養液を遠心(12000rpm,5min)し、上清を捨てる。
  2. 沈殿を50ｍM glucose; 10mM EDTA; 25mM Tris-HCl (pH 8.0) 100μlで再懸濁する。
  3. 0.2N NaOH; 1％ SDS（用時調整）200μlを加え混合し、氷上で5minインキュベートする。
  4. 3M Potassium Acetate (pH 4.8) 150μl を加えよく混合し、氷上5minインキュベートする。
  5. 遠心(12000rpm,5min)し、遠心後上清を回収する。

Digestion

  • Micro Tube
  • Micro pipette
  • Heat Block　or Water bus
  • Digest Enzyme
  • 10×Buffer　
  • DW


  1. Tubeに加え、混合する.
  2. 37℃でインキュベートする（2～16ｈ）

Ligation

  • Micro Tube
  • Micro pipette
  • Heat Block
  • T4 Ligase
  • 10× Buffer　
  • DW


  1. Tubeに加え、混合する.
  2. 16℃でインキュベートする（30min～1ｈ）

Transformation

  • Micro pipette
  • Heat Block　or Water bus
  • ECOS™ Competent E. coli
  • Plate (Antibiotic)
  • Spreader


  1. 氷上でコンピテントセルを融解する。
  2. 4℃または氷上で冷却したプラスミド溶液またはライゲーション溶液(コンピテントセルの5％以下)を加える。
  3. 直ちにボルテックスで 1秒間撹拌する。
  4. 氷上で 5minインキュベートする。
  5. 直ちに 42℃で 45 secインキュベートする。
  6. 氷上で 2minインキュベートする。
  7. あらかじめ37℃で保温しておいた Hi-Competence Broth またはSOC培地を、コンピテントセルの 4倍量程度加え、37℃で30minインキュベートする（この作業はアンピシリン使用時省く）
  8. 100 µl～全量を LB Plateに移し均一に塗布する。
  9. 37℃で 12～16hインキュベートする.

Colony PCR(Takara EX® Taq)

  • Plate
  • Ice
  • Micro pipette
  • Thermal cycler
  • Burner
  • 70％EtOH
  • Toothpick (爪楊枝)
  • PCRTube
  • Micro Tube
  • Spreader
  • DW
  • 10× PCR Buffer
  • dNTP (2.5mM)
  • primer(Forward & Reverse)　(20µM)
  • Taq Polymerase


  1. 培養し、プレートに形成されたコロニーに番号を振る。（数が多い際は、他のコロニーと距離が離れている、コロニーが大きい等の基準から48のコロニーをピックアップする）
  2. 何も生やしていない抗生物質入りの培地の裏に、１で振った番号を等間隔に書きこむ。（このプレートをマスタープレートという）
  3. コロニーの数分、以下の組成でDW→Buffer→dNTP→primer→polymeraseの順に混ぜていく。調製は氷上で行う。
  4. 良く撹拌(×ボルテックス)した後、氷上のPCRTubeに分注する（25µlずつ）
  5. ガスバーナーの火下で、ⅰ)爪楊枝で番号を振ったコロニー(番号は①から)をつつき、ⅱ)PCRTubeに突っ込み、

ⅲ)マスタープレートの対応した番号の場所に刺す。（この3つ作業は同じ爪楊枝で行う）

  1. 5の作業をコロニーの数繰り返す。
  2. すべてのコロニー分のPCRTubeを作り終えたらThermal cyclerにセットし、RUNする。
  3. 反応終了後、電気泳動にて結果を観察 or 4℃で保存。

Making Medium for Culture

Making Gel for Electrophoresis

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