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Team:Tokyo Metropolitan/Notebook
From 2011.igem.org
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Contents |
Lab Notebook
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Lab Protocols
PCR (PrimeSTAR® HS DNA Polymerase)
- Ice
- Micro pipette**Thermal cycler
- PCR Tube
- Micro Tube
- DW
- 5× PCR Buffer
- dNTP (2.5mM)
- Primer(Forward & Reverse) (20µM)
- Template DNA
- PrimeSTAR® HS DNA Polymerase (2.5U/μl)
- 以下の組成で、DW→Buffer→dNTP→primer→Template DNA→polymeraseの順に混ぜていく。反応液の調製は氷上で行う。Template DNAが液体の場合、その分DWの量を減らす。
- 良く撹拌(×ボルテックス)した後、氷上のPCR Tubeに分注する（50µlずつ）
- Thermal cyclerにセットし、RUNする。
- 98℃・・・10sec
- 55℃・・・5 or 15sec
- 72℃・・・1min×1kbpごと 30cycle
- 反応終了後、電気泳動にて結果を観察 or 4℃で保存。
Electrophoresis
- Gel
- 泳動槽
- Parafilm
- Micro pipette
- TAE Buffer
- 6× Loading Buffer
- DW
- 5× PCR Buffer
- 泳動槽にゲルをセットし、TAE Bufferをゲルが浸るまで入れる。
- Loading Buffer・・・1µl
- DNA solution・・・5µl
- DW・・・5µlをParafilmの上で、ピペッティングにより混ぜ、ゲルのウェルに入れる。
- 電流を流し、泳動する。（100V：通常のとき、50V：ゆっくりと丁寧に流したいとき）
- 紫外光をあてバンドを確認する。
Ethanol precipitation
- Centrifuge
- Micro Tube
- Micro pipette
- Aspirator
- 99.5％Ethanol
- 3.0M Sodium acetate (pH5.2)
- TE Buffer
- 核酸（DNAまたはRNA）溶液に1/10量の3.0M Sodium acetateを加え混合する。
- 溶液100µlあたり1µl（溶液が400µl以下の時は4µl）のGenとるくんエタ沈キャリアーを加え混合する。
- 2.5倍量のEthanolを加え十分混合し、遠心(12000rpm,15min,4℃,)する。
- 遠心後、上清を除き、70%Ethanolを加え(3の総量と同量)混合し、遠心(12000rpm,5min,4℃,)する。＝洗い
- 遠心後、上清を除き、乾燥する。
- 適当量のDWまたは TE Bufferを加え、沈殿を再溶解する。
Plasmid Extraction
- Ice
- Micro Tube
- Micro pipette
- Centrifuge
- 50ｍM glucose ; 10mM EDTA ; 25ml Tris-HCl (pH 8.0)
- 5N NaOH
- 10％ SDS
- 3M Potassium Acetate (pH 4.8)
- 菌の前培養液を遠心(12000rpm,5min)し、上清を捨てる。
- 沈殿を50ｍM glucose; 10mM EDTA; 25mM Tris-HCl (pH 8.0) 100μlで再懸濁する。
- 0.2N NaOH; 1％ SDS（用時調整）200μlを加え混合し、氷上で5minインキュベートする。
- 3M Potassium Acetate (pH 4.8) 150μl を加えよく混合し、氷上5minインキュベートする。
- 遠心(12000rpm,5min)し、遠心後上清を回収する。
