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Contents 1 Lab Notebook 2 Lab Protocols 2.1 PCR (PrimeSTAR® HS DNA Polymerase) 2.2 Electrophoresis 2.3 Ethanol precipitation 2.4 Plasmid Extraction 2.5 Digestion 2.6 Ligation 2.7 Transformation 2.8 Colony PCR(Takara EX® Taq) 2.9 Making Medium for Culture 2.10 Making Gel for Electrophoresis

Lab Notebook

Lab Protocols

PCR (PrimeSTAR® HS DNA Polymerase)

• Ice
• Micro pipette**Thermal cycler
• PCR Tube
• Micro Tube
• DW
• 5× PCR Buffer
• dNTP　(2.5mM)
• Primer(Forward & Reverse)　 (20µM)
• Template DNA
• PrimeSTAR® HS DNA Polymerase　(2.5U/μl)

1. Add the all following components on ice.
2. Mix thoroughly. Add

Electrophoresis

• Gel
• 泳動槽
• Parafilm
• Micro pipette
• TAE Buffer
• 6× Loading Buffer
• DW
• 5× PCR Buffer

1. Set gel in a gel tank. Pour the TAE Buffer into the gel tank.
   • Loading Buffer
   • DNA solution
   • DW
2. Mix these components on a Parafilm by pipetting.
3. Pour the mixture sample into well.
4. Switch on the power-source and run the gel at 100V for 20min.
5. Observe the band by exposing ultraviolet radiation

Ethanol precipitation

• Centrifuge
• Micro Tube
• Micro pipette
• Aspirator
• 99.5％Ethanol
• 3.0M Sodium acetate (pH5.2)
• TE Buffer

1. Add 0.1 volume 3M Sodium acetate to the nucleic acid sample and vortex.
2. Add 4 µl of Dr. GenTLETM Precipitation Carrier and vortex.
3. Add 2.5 volumes of ethanol and vortex.
4. Centrifuge at 12,000 rpm at 4˚C for 15 min.
5. Discard the supernatant.
6. Rinse the pellet with 70% ethanol and centrifuge again at 12,000 rpm at 4˚C for 5 min.
7. Discard the supernatant and dry.
8. Dissolve the pellet in sterilized water or TE buffer.

Plasmid Extraction

• Ice
• Micro Tube
• Micro pipette
• Centrifuge
• 50ｍM glucose ; 10mM EDTA ; 25ml Tris-HCl (pH 8.0)
• 5N NaOH
• 10％ SDS
• 3M Potassium Acetate (pH 4.8)

1. Centrifuge the E-coli pre-culture on 12,000 rpm for 5min, and then discard the supernatant.
2. Add 100µl of the solution (50ｍM glucose; 10mM EDTA; 25ml Tris-HCl(pH 8.0)), and mix it gently
3. Add 200µl of the 0.2N NaOH; 1％ SDS, and mix it. Incubate on ice for 5min.
4. Add 150µl of 3M Potassium Acetate (pH 4.8, 5M Acetic acid; 3M Potassium), and mix it. Incubate #on ice for 5min.
5. Centrifuge on 12,000 rpm for 5min.
6. Take supernatant.

Digestion

• Micro Tube
• Micro pipette
• Heat Block　or Water bus
• Digest Enzyme
• 10×Buffer　
• DW

1. Add below components into a tube and mix them.
   • DNA solution
   • DW
   • 10× Buffer
   • Digest enzyme
2. Incubate at 37°C. from 2h to 16h

Ligation

• Micro Tube
• Micro pipette
• Heat Block
• T4 Ligase
• 10× Buffer　
• DW

1. Add below components into a tube and mix them.
   • DNA solution 1
   • DNA solution 2　　　
   • DW
   • 10× Buffer
   • T4 Ligase
2. Incubate at 16°C, from 30min to 1h

Transformation

• Micro pipette
• Heat Block　or Water bus
• ECOS™ Competent E. coli
• Plate (Antibiotic)
• Spreader

1. 氷上でコンピテントセルを融解する。
2. 4℃または氷上で冷却したプラスミド溶液またはライゲーション溶液(コンピテントセルの5％以下)を加える。
3. 直ちにボルテックスで 1秒間撹拌する。
4. 氷上で 5minインキュベートする。
5. 直ちに 42℃で 45 secインキュベートする。
6. 氷上で 2minインキュベートする。
7. あらかじめ37℃で保温しておいた Hi-Competence Broth またはSOC培地を、コンピテントセルの 4倍量程度加え、37℃で30minインキュベートする（この作業はアンピシリン使用時省く）
8. 100 µl～全量を LB Plateに移し均一に塗布する。
9. 37℃で 12～16hインキュベートする.

Colony PCR(Takara EX® Taq)

• Plate
• Ice
• Micro pipette
• Thermal cycler
• Burner
• 70％EtOH
• Toothpick (爪楊枝)
• PCRTube
• Micro Tube
• Spreader
• DW
• 10× PCR Buffer
• dNTP (2.5mM)
• primer(Forward & Reverse)　(20µM)
• Taq Polymerase

1. 培養し、プレートに形成されたコロニーに番号を振る。（数が多い際は、他のコロニーと距離が離れている、コロニーが大きい等の基準から48のコロニーをピックアップする）
2. 何も生やしていない抗生物質入りの培地の裏に、１で振った番号を等間隔に書きこむ。（このプレートをマスタープレートという）
3. コロニーの数分、以下の組成でDW→Buffer→dNTP→primer→polymeraseの順に混ぜていく。調製は氷上で行う。
4. 良く撹拌(×ボルテックス)した後、氷上のPCRTubeに分注する（25µlずつ
5. ガスバーナーの火下で、ⅰ)爪楊枝で番号を振ったコロニー(番号は①から)をつつき、ⅱ)PCRTubeに突っ込み、ⅲ)マスタープレートの対応した番号の場所に刺す。（この3つ作業は同じ爪楊枝で行う）
6. 5の作業をコロニーの数繰り返す。
7. すべてのコロニー分のPCRTubeを作り終えたらThermal cyclerにセットし、RUNする。
8. 反応終了後、電気泳動にて結果を観察 or 4℃で保存。

Making Medium for Culture

• Erlenmeyer flask
• Graduated cylinder
• Test Tube or Plate
• Autoclave
• Stirrer
• Electronic balance
• Burner or Clean bench
• Yeast Extract
• Peptone
• NaCl
• Antibiotic
• Agar

1. 電子天秤で目的培地の材料の量を測りとる。
2. 測り取った試薬にDWを目的量の9割程度加え、よく撹拌し溶解する。
3. DWで目的量までメスアップする（メスシリンダーを使う必要なし)
4. 試験管に10mlずつ分注し、121℃で15minオートクレーブにかける。
5. オートクレーブ後、抗生物質を入れる場合、培地を50～60℃に冷ましてから、無菌条件(バーナーの火下約30cm以内or　Clean bench内)で指定濃度になるように加える。
6. 無菌状態(バーナーの火下約30cm以内or　Clean bench内)で培地をプレートに分注し、冷まして固まらせる。
7. 無菌条件下で蓋をあけ、十分に乾燥させた後に4℃で保存する。

Making Gel for Electrophoresis

• Erlenmeyer flask
• Graduated cylinder
• Type of gel
• Microwave oven
• Electronic balance
• Agarose
• TAE Buffer
• EtBr Solution

1. TAE Bufferに任意の濃度（0.8～1.5％）になるようにAgaroseを加え、混ぜる。
2. レンジで加熱し、Agaroseを完全に溶解させる。
3. 50～60℃に冷まし、終濃度5µg/mlになるようにEtBr溶液を加える。
4. 型に流し込み、コームを刺し、固める。小さいウェル（10µl用）はPCRなどの確認用、大きいウェル（20µl用）はDNAのゲル抽出用（目的のバンドの分離用）である。
5. コームを抜き、使用 or 保存する。