Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNote/GFPMLF9J

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9月1日

Member

中川


1.[http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx QIAquick Gel Extraction Kit]を使用してゲルからpSB1C3のDNAを抽出し、濃度を測定した。
2.8/30に再設計したプライマーを用いて以下の条件でBBa_E0240のPCRを行った。


PCR条件
10 µM GFP Primer F1.5 µl
10 µM GFP Primer R1.5 µl
BBa_E02401 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs4 µl
MgSO44 µl
ddH2O32 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature95°C30sec 
Denature95°C30sec30 Cycle
Anneling50°C1min
Extension68°C1min
End4°Ckeep 




Results

1.泳動後の写真

約2kbのところにバンドが見られた。


抽出したゲルのうち5 µlを20倍希釈し、吸光計で濃度測定をしたところ、濃度は17.8ng/µlと算出された。


1回目0.019
2回目0.013
3回目0.019
4回目0.022
5回目0.016
ave.0.0178



2.9月2日に続く


9月2日

Member

中川


昨日のBBa_E0240のPCR産物のフェノールクロロホルム処理、PCR産物の増幅を確認するための電気泳動、PCR産物の制限酵素処理を行った。
制限酵素処理は、下記の表に従って反応液を調整し、37°Cでインキュベートした。(overnight)



Results

泳動後の写真


PCR産物の増幅が確認できた。


9月3日

Member

中川


[http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx QIAquick Gel Extraction Kit]を使用して制限酵素処理済みのBBa_E0240をゲル抽出した。


Results



9月5日

Member

中川


下表に従ってpSB1C3(19 ng/µl)とBBa_E0240(noATG GFP、25 ng/µl)のライゲーションを行った。


BBa_E02400.5 µl
pSB1C30.5 µl
10 x Buffer2.5 µl
F4 ligase0.5 µl
ddH2O1.0 µl
 total 5 µl


16°C、30minでincubateした後、形質転換を行った。



Results

コロニーは全く生えていなかった。
インサートとベクターの量に注意して再度ライゲーションを行う。


9月6日

Member

吉村、中川


1.ベクターとインサートの濃度比を1:9にして昨日と同様にライゲーションを行った。
2.Flag-tag dMLFのプライマー設計


Results

1.翌日、4つのコロニーが確認できた。
2.F:AAAGAATTCAAATCTAGAAAAATGGACTACAAGGACGA
      EcoRⅠ  Xba
Tm値:72.14℃ 38塩基
R:AAACTGCAGAAAACTAGTAAATACCCTACTTCTTCTTGCC
     PstⅠ   Spe
Tm値:72.16℃ 40塩基


9月7日

Member

中川


1.昨日ライゲーションしてできたコロニーのプレカルチャー
2.pSB1C3のプレカルチャー
3.以下のプログラムでFlag-tag dMLFのPCRを行った。
PCR条件
10 µM GFP Primer F1.5 µl
10 µM GFP Primer R1.5 µl
Flag tag dMLF1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs4 µl
MgSO44 µl
ddH2O32 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature95°C30sec 
Denature95°C30sec30 Cycle
Anneling50°C1min
Extension68°C1min
End4°Ckeep 


下表に従ってPCR産物の制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
ddH2O2 µl
Flag-tag dMLF50 µl
EcoRⅠ1 µl
Pst1 µl
10 x H Buffer6 µl
 total 60 µl


Results


9月8日

Member

中川


1.Flag tag dMLFのゲル抽出
2.pSB1C3のアルカリミニプレップをした後、フェノールクロロホルム処理をした後、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
pSB1C3in ddH2O50 µl
EcoR1 µl
Pst1 µl
10 x H Buffer6 µl
 total 58 µl
37°Cで20時間静置した。


Results

1.MLFを切り出すときにほとんどバンドは見えなかった。
そこでまずはベクターとGFPのライゲーションに明日から力を入れることにした。


9月9日

Member

中川


ベクターとGFPのライゲーションのためのエタノール沈殿
エタノール沈殿をすることでベクターとGFPの濃度をあげ、ライゲーションの効率を上げる



Results

エタノール沈殿に失敗し沈殿すべきDNAが見当たらず濃度を濃く出来なくなった。



9月12日

Member

吉村、中川


9/6に作製したプライマーを用いて、Flag-tag dMLFについて以下の2条件で各1サンプルずつPCRを行った。
PCR条件(1)
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs4 µl
MgSO44 µl
ddH2O32 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling55°C30sec
Extension68°C1min 20sec
End4°Ckeep 


PCR条件(2)
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs4 µl
MgSO42 µl
ddH2O34 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling55°C30sec
Extension68°C1min 20sec
End4°Ckeep 
各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。




Results


9月13日

Member

吉村、中川



Results


9月14日

Member

吉村、中川


1.PCRでFlag-MLFが増幅しているかを調べるため電気泳動を行った。
2.pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理、制限酵素処理



Results

泳動後の写真


ゲルの濃度を2倍にしたところ、マーカーが流れなかったので、Flag-tag MLFの電気泳動に関しては今後、2%のアガロースゲルで行うこととする。