"
Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNote/GFPMLF9J
From 2011.igem.org
 |
|
| Home | Team | Project | Parts | Notebook | Safety | Human Practice | Attributions |
|---|
| Home > Notebook > Lab Note > September | Language：English/Japanese |
|---|
９月１日
Member
- 中川
- 1.QIAquick Gel Extraction Kitを使用してゲルからpSB1C3のDNAを抽出し、濃度を測定した。
- 2.8/30に再設計したプライマーを用いて以下の条件でBBa_E0240のPCRを行った。
PCR条件 10 µM GFP Primer F 1.5 µl 10 µM GFP Primer R 1.5 µl BBa_E0240 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl total 50 µl Cycle条件 Pre-Denature 95°C 30sec Denature 95°C 30sec 30 Cycle Anneling 50°C 1min Extension 68°C 1min End 4°C keep
Results
- 1.泳動後の写真
-
- 約2kbのところにバンドが見られた。
- 抽出したゲルのうち5 µlを20倍希釈し、吸光計で濃度測定をしたところ、濃度は17.8ng/µlと算出された。
1回目 0.019 2回目 0.013 3回目 0.019 4回目 0.022 5回目 0.016 ave. 0.0178
- 2.９月２日に続く
９月２日
Member
- 中川
- 昨日のBBa_E0240のPCR産物のフェノールクロロホルム処理、PCR産物の増幅を確認するための電気泳動、PCR産物の制限酵素処理を行った。
- 制限酵素処理は、下記の表に従って反応液を調整し、37°Cでインキュベートした。(overnight)
Results
- 泳動後の写真
-
- PCR産物の増幅が確認できた。
９月３日
Member
- 中川
- QIAquick Gel Extraction Kitを使用して制限酵素処理済みのBBa_E0240をゲル抽出した。
Results
９月５日
Member
- 中川
- 下表に従ってpSB1C3(19 ng/µl)とBBa_E0240(noATG GFP、25 ng/µl)のライゲーションを行った。
BBa_E0240 0.5 µl pSB1C3 0.5 µl 10 x Buffer 2.5 µl F4 ligase 0.5 µl ddH2O 1.0 µl total 5 µl
- 16°C、30minでincubateした後、形質転換を行った。
Results
- コロニーは全く生えていなかった。
- インサートとベクターの量に注意して再度ライゲーションを行う。
９月６日
Member
- 吉村、中川
- 1.ベクターとインサートの濃度比を1:9にして昨日と同様にライゲーションを行った。
- 2.Flag-tag dMLFのプライマー設計
Results
- 1.翌日、4つのコロニーが確認できた。
- 2.F：AAAGAATTCAAATCTAGAAAAATGGACTACAAGGACGA
- EcoRⅠ XbaⅠ
- Tm値:72.14℃ 38塩基
- R：AAACTGCAGAAAACTAGTAAATACCCTACTTCTTCTTGCC
- PstⅠ SpeⅠ
- Tm値:72.16℃ 40塩基
９月７日
Member
- 中川
- 1.昨日ライゲーションしてできたコロニーのプレカルチャー
- 2.pSB1C3のプレカルチャー
- 3.以下のプログラムでFlag-tag dMLFのPCRを行った。
PCR条件 10 µM GFP Primer F 1.5 µl 10 µM GFP Primer R 1.5 µl Flag tag dMLF 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl total 50 µl Cycle条件 Pre-Denature 95°C 30sec Denature 95°C 30sec 30 Cycle Anneling 50°C 1min Extension 68°C 1min End 4°C keep
- 下表に従ってPCR産物の制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
ddH2O 2 µl Flag-tag dMLF 50 µl EcoRⅠ 1 µl PstⅠ 1 µl 10 x H Buffer 6 µl total 60 µl
Results
９月８日
Member
- 中川
- 1.Flag tag dMLFのゲル抽出
- 2.pSB1C3のアルカリミニプレップをした後、フェノールクロロホルム処理をした後、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
pSB1C3in ddH2O 50 µl EcoRⅠ 1 µl PstⅠ 1 µl 10 x H Buffer 6 µl total 58 µl - 37°Cで20時間静置した。
Results
- 1.MLFを切り出すときにほとんどバンドは見えなかった。
- そこでまずはベクターとGFPのライゲーションに明日から力を入れることにした。
９月９日
Member
- 中川
- ベクターとGFPのライゲーションのためのエタノール沈殿
- エタノール沈殿をすることでベクターとGFPの濃度をあげ、ライゲーションの効率を上げる
Results
- エタノール沈殿に失敗し沈殿すべきDNAが見当たらず濃度を濃く出来なくなった。
９月１２日
Member
- 吉村、中川
- 9/6に作製したプライマーを用いて、Flag-tag dMLFについて以下の2条件で各1サンプルずつPCRを行った。
PCR条件(1) 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl total 50 µl Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 55°C 30sec Extension 68°C 1min 20sec End 4°C keep
PCR条件(2) 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 2 µl ddH2O 34 µl KOD Plus 1 µl total 50 µl Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 55°C 30sec Extension 68°C 1min 20sec End 4°C keep
- 各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
Results
９月１３日
Member
- 吉村、中川
Results
９月１４日
Member
- 吉村、中川
- 1.PCRでFlag-MLFが増幅しているかを調べるため電気泳動を行った。
- 2.pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理、制限酵素処理
Results
- 泳動後の写真
- ゲルの濃度を2倍にしたところ、マーカーが流れなかったので、Flag-tag MLFの電気泳動に関しては今後、2%のアガロースゲルで行うこととする。
