Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNote/DIAP2-MALT9

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1st, September

Member

Takeda


Again different annealing conditions were tested.
PCR reaction
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl or 4 µl
ddH2O33 µl or 31 µl
KOD+ polymelase1 µl
 total 50 µl
Cycle
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cyle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C100sec
End4°Ckeep 
PCR products were applied to the agarose gel electrophoresis.


Results

Image of the agarose gel.



5th, September

Member

Yokoigawa, Takeda


The PCR products for DIAP2 was treated wit phenol-chloroform and then digested with the XhoI for 20 hours at 37°C.
DIAP2
PCR reaction in ddH2O44 μl
10 x H Buffer5 μl
Xho1 μl
 total 50 μl


6th, September

Member

Yokoigawa, Takeda


The PCR products for DIAP2 was treated wit phenol-chloroform and then digested with the XbaI for 20 hours at 37°C.
DIAP2
PCR reaction in ddH2O44 μl
10 x M Buffer5 μl
Xba1 μl
 total 50 μl


7th, September

Member

Yokoigawa, Takeda


The restriction enzyme-digested PCR fragments and pUAST-flag DNA were extracted from the agarose gel by[http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx QIAquick Gel Extraction Kit].


Results

PCR products for DIAP2 Was not successfully recovered from the agarose gel.


12th, September

Member

Matsunami, Yokoigawa


To amplify DIAP2 cDNA, PCR reactions were carried out by using the following primers and under the following conditions.
F primer GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm value    62 °C
R primer GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm value    66.4°C
amplicon size  1514 bp


PCR reaction
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl
ddH2O33 µl
KOD+ polymelase1 µl
 total 50 µl
Cycle
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C1min40sec
End4°Ckeep 


Again different annealing conditions were tested.
Annealing 50.5°C


13th, September

Member

Matsunami, Yokoigawa


PCR products on 12th September were applied to the agarose gel electrophoresis.


Results

Image of the agarose gel.


Lane 1;DNA size marker(1 Kbp ladder)
Lanes 2 and 3;DIAP2 cDNA
Amplified DNA fragments were barely detectable for the DIAP2.


9月14日

Member

松浪、横井川


API2-MALT1について以下のプライマーを用いて、以下の条件でPCRを行った。
F primer GCCGCTCGAGACATAGTAGAAAACAGCAT
Tm値    57.7 °C
R primer GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値    56.5 °C
増幅サイズ  約3131 bp


PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling51.5°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


マーカー(1 Kbp)のみバンドが見られた。

9月15日

Member

松浪、横井川


API2-MALT1、DIAP2について、以下の条件でPCRを行った。
API2-MALT1
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling53°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 


DIAP2
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl
ddH2O33 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C1min 40sec
End4°Ckeep 
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


DIAP2のPCR産物を、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x H Buffer5 µl
Xho1 µl
 total 50 µl

37°Cで20時間静置した。
Results

泳動後の写真


左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2~5レーン;DIAP2、6~8レーン;API2-MALT1
DIAP2に関しては予想される位置にバンドが見られたが、API2-MALT1は見られなかった。


9月16日

Member

松浪、横井川


DIAP2のPCR産物を、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x M Buffer5 µl
Xba1 µl
 total 50 µl


9月17日

Member

松浪、横井川


制限酵素処理を行ったDIAP2のプラスミドを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


マーカー(1 Kbp)のバンドのみが見られた。制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなかった。


9月18日

Member

松浪


コンピテントセル(DH5α)を作成した。


9月19日

Member

松浪


コンピテントセル(DH5α)を作成した。


9月21日

Member

松浪


1.コンピテントセル(DH5α)を作成した。
2.DIAP2について、以下の条件でPCRを行った。
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl
ddH2O33 µl
KOD+ polymelase1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C1kb/min
End4°Ckeep 
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


DIAP2のPCR産物を、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x H Buffer5 µl
Xho1 µl
 total 50 µl


Results

1.ODを測定したが、OD=0.9を超えてしまった。
泳動後の写真


左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2~7レーン;DIAP2
全てのサンプルでPCRが成功した。


9月22日

Member

不明★


DIAP2のPCR産物を、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x M Buffer5 µl
Xba1 µl
 total 50 µl


9月23日

Member

松浪


制限酵素処理を行ったDIAP2のプラスミドを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


マーカー(1 Kbp)のみバンドが見られ、制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなった。


9月25日

Member

松浪


コンピテントセル(DH5α)を作成した。


9月27日

Member

松浪


コンピテントセル(DH5α)を作成した。