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Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNote/GFPMLF9J
From 2011.igem.org
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| Home > Notebook > Lab Note > September | Language：English/Japanese |
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９月１日
Member
- 中川
- QIAquick Gel Extraction Kitを使用してゲルからpSB1C3のDNAを抽出し、濃度を測定した。
- 8/30に再設計したプライマーを用いて以下の条件でPCRを行った。
PCR条件 10 µM GFP Primer F 1.5 µl 10 µM GFP Primer R 1.5 µl BBa_E0240 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl total 50 µl Cycle条件 Pre-Denature 95°C 30sec Denature 95°C 30sec 30 Cycle Anneling 50°C 1min Extension 68°C 1min End 4°C keep
Results
- 泳動後の写真
-
- 約2kbのところにバンドが見られた。
- 抽出したゲルのうち5 µlを20倍希釈し、吸光計で濃度測定をした。
1回目 0.019 2回目 0.013 3回目 0.019 4回目 0.022 5回目 0.016 ave. 0.0178
- 濃度は17.8ng/µlと算出された。
９月２日
Member
- 中川
- 1.BBa_E0240のプレカルチャー
- 2.BBa_E0240からATG GFPを作るためのプライマー設計
Results
- 1.全てのサンプルに大腸菌の増殖がみられた。
- 2.以下のように設計した。
- F: 3' TTGAATTCTTTCTAGATTCGTAAAGGAGAAGAA
- F: 3' TTGAATTCTTTCTAGATTCGTAAAGGAGAAGAA
EcoRⅠ XbaⅠ
- Tm値:67.75°C 33塩基
- Tm値:67.75°C 33塩基
- R: 5' AAACTGCAGAAAACTAGTTTTTTATTATTTGTATAG
- R: 5' AAACTGCAGAAAACTAGTTTTTTATTATTTGTATAG
PstⅠ SpeⅠ
- Tm値:67.66°C 36塩基
９月３日
Member
- 吉村、中川
- BBa_E0240のアルカリミニプレップをした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。
ddH2O 2 µl BBa_E0240 50 µl EcoRⅠ 1 µl PstⅠ 1 µl 10 x H Buffer 6 µl total 60 µl
- 制限酵素処理後、100 V 30minでアガロース電気泳動行った。
Results
- 泳動後の写真
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- 800bpあたりにバンドが出ていた。
９月４日
Member
- 吉村、中川
- 23日に作製したプライマーを用いて、以下の条件でPCRを行った。
PCR条件 10 µM GFP Primer F 1.5 µl 10 µM GFP Primer R 1.5 µl BBa_E0240 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl total 50 µl Cycle条件 Pre-Denature 95°C 30sec Denature 95°C 30sec 30 Cycle Anneling 50°C 1min Extension 68°C 1min End 4°C keep
- PCR産物が増幅していることを確認するため、アガロース電気泳動を行った。
- PCR産物の増幅を確認した後、下表に従ってPCR産物の制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
ddH2O 2 µl BBa_E0240 50 µl EcoRⅠ 1 µl PstⅠ 1 µl 10 x H Buffer 6 µl total 60 µl
Results
- 泳動後の写真
-
- 800bpあたりにバンドが見られ、PCR産物の増幅が確認できた。
９月５日
Member
- 中川
- 1.ゲルからのDNA抽出
- 2.pSB1C3のトランスフォーメーション
Results
- 1.ゲル切り出し後の写真
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- 濃度は510 ng/µlだった。
- 2.小さいが、コロニーが生えていた。念のために、翌日再度トランスフォーメーションをする。
９月６日
Member
- 吉村
- pSB1C3のトランスフォーメーション
Results
- 小さいコロニーの生育がみられた。
９月７日
Member
- 吉村、中川
- pSB1C3のプレカルチャー(6サンプル)
Results
- 6サンプルのうち3サンプルは培養に成功した。
- 3サンプルはコンタミの可能性があるため、念を入れて翌日もプレカルチャーを行うことにした。
９月８日
Member
- 中川
- 1.pSB1C3のプレカルチャー(6サンプル)
- 2.プライマーの再設計
Results
- 1.コンタミすることなく培養に成功した。
- 2.以下のように設計した。
- F: 3' TTGAATTCTTTTCTAGATTTCGTAAAGGAGAAGAA
- F: 3' TTGAATTCTTTTCTAGATTTCGTAAAGGAGAAGAA
EcoRⅠ XbaⅠ
- Tm値:68.8゜C 35塩基
- Tm値:68.8゜C 35塩基
８月３１日
Member
- 中川
- pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理をした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。
ddH2O 2 µl BBa_E0240 50 µl EcoRⅠ 1 µl PstⅠ 1 µl 10 x H Buffer 6 µl total 60 µl
- 制限酵素処理後、100 V 30minで電気泳動を行った。
Results
- 泳動後の写真
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