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From 2011.igem.org

8/22(月)
吉村、中川、松浪

・BBa_E0240のトランスフォーメーション
【結果】
コロニーの生育がみられた。

8/23(火)
吉村、中川

・BBa_E0240のプレカルチャー

【結果】
全てのサンプルに大腸菌の増殖がみられた。

・BBa_E0240からno ATG GFPを作るため以下のようにプライマー設計をした。

F: 3' TTGAATTCTTTCTAGATT CGTAAAGGAGAAGAA
　　　　　EcoRⅠ　　　　XbaⅠ
Tm値:67.75゜C　　33塩基

R: 5' AAACTGCAGAAAACTAGTTTTTTATTATTTGTATAG
　　　　　 PstⅠ　　　　　SpeⅠ
Tm値:67.66゜C　　36塩基





8/24(水)　11:00～
吉村、中川

BBa_E0240のアルカリミニプレップをした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。

ddH2O	2 µl
BBa_E0240	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

制限酵素処理後、100 V 30minで電気泳動した。
【結果】
泳動後の写真

800bpあたりにバンドが出ていた。




8/25(木)　11:00～
吉村、中川

PCR

以下の条件でPCRを行った。

PCR条件 10 µM GFP Primer F 1.5 µl 10 µM GFP Primer R 1.5 µl 鋳型 DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl   全量 50 µl

Cycle条件 Start 95°C、30秒 Cycle x 30 95°C、30秒(熱変性) (Tm-5)°C、1分(アニーリング) 68°C、1kb/分(伸長) End 4°Cで保持

PCR産物が増幅していることを確認するため、アガロース電気泳動を行った。

泳動後の写真

800bpあたりにバンドが見られ、PCR産物の増幅が確認できた。


PCR産物の増幅を確認した後、下表に従ってPCR産物の制限酵素処理を行った。

ddH2O	2 µl
BBa_E0240	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

37゜Cでインキュベートした(overnight)。






8/26(金)
中川　17:00～

・ゲルからのDNA抽出

ゲル切り出し後の写真


濃度は510 ng/µlだった。



・pSB1C3のトランスフォーメーション

【結果】
小さいが、コロニーが生えていた。
念のために、翌日再度トランスフォーメーションをする。


8/27(土)
吉村

pSB1C3のトランスフォーメーション

【結果】
小さいコロニーの生育がみられた。





8/29(月)
pSB1C3のプレカルチャーを6サンプル行った。

【結果】
6サンプルのうち3サンプルは培養に成功したが、3サンプルはコンタミの可能性があるため、念を入れて翌日もプレカルチャーを行うことにした。





8/30(火)
(目的)
大会提出用ベクターpsb1c3の培養→トラフォ(二回目) (方法)
8/26に培養した提出用ベクターのコロニーの生えたプレートを昨日同様用いた
↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養する

(結果)
翌日6本培養したがコンタミすることなく無事に大腸菌を回収することができた








8/31(水)
中川

pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理、電気泳動、制限酵素処理