Team:KIT-Kyoto/GFP-MLF実験かんたん

From 2011.igem.org

8/22(月)
吉村、中川、松浪

・BBa_E0240のトランスフォーメーション
【結果】
コロニーの生育がみられた。






8/23(火)
吉村、中川

・BBa_E0240のプレカルチャー

【結果】
全てのサンプルに大腸菌の増殖がみられた。



・BBa_E0240からno ATG GFPを作るため以下のようにプライマー設計をした。

F: 3' TTGAATTCTTTCTAGATTCGTAAAGGAGAAGAA
     EcoRⅠ    Xba
Tm値:67.75゜C  33塩基

R: 5' AAACTGCAGAAAACTAGTTTTTTATTATTTGTATAG
      PstⅠ     Spe
Tm値:67.66゜C  36塩基





8/24(水) 11:00~
吉村、中川

BBa_E0240のアルカリミニプレップをした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。
ddH2O2 µl
BBa_E024050 µl
EcoRⅠ1 µl
Pst1 µl
10 x H Buffer6 µl
 total 60 µl

制限酵素処理後、100 V 30minで電気泳動した。
【結果】
泳動後の写真

800bpあたりにバンドが出ていた。




8/25(木) 11:00~
吉村、中川

8/23に設計したプライマーを用いて、以下の条件でPCRを行った。
PCR条件
10 µM GFP Primer F1.5 µl
10 µM GFP Primer R1.5 µl
BBa_E02401 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs4 µl
MgSO44 µl
ddH2O32 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Start95°C、30秒
Cycle x 3095°C、30秒(熱変性)
50°C、1分(アニーリング)
68°C、1kb/分(伸長)
End4°Cで保持

PCR産物が増幅していることを確認するため、アガロース電気泳動を行った。

泳動後の写真

800bpあたりにバンドが見られ、PCR産物の増幅が確認できた。


PCR産物の増幅を確認した後、下表に従ってPCR産物の制限酵素処理を行った。(37゜C、overnight)。
ddH2O2 µl
BBa_E024050 µl
EcoRⅠ1 µl
Pst1 µl
10 x H Buffer6 µl
 total 60 µl







8/26(金)
中川 17:00~

・ゲルからのDNA抽出

ゲル切り出し後の写真


濃度は510 ng/µlだった。



・pSB1C3のトランスフォーメーション

【結果】
小さいが、コロニーが生えていた。
念のために、翌日再度トランスフォーメーションをする。


8/27(土)
吉村

pSB1C3のトランスフォーメーション

【結果】
小さいコロニーの生育がみられた。





8/29(月)
中川
・pSB1C3のプレカルチャーを6サンプル行った。

【結果】
6サンプルのうち3サンプルは培養に成功したが、3サンプルはコンタミの可能性があるため、念を入れて翌日もプレカルチャーを行うことにした。



8/30(火)
中川
大会提出用ベクターpSB1C3のプレカルチャーを6サンプル行った。

【結果】
コンタミすることなく培養に成功した。


・8/23に設計したプライマーだと、フレームシフトをおこしている可能性があったため、プライマーの再設計を行った。
F: 3' TTGAATTCTTTTCTAGATTTCGTAAAGGAGAAGAA
     EcoRⅠ     Xba
Tm値:68.8゜C  35塩基






8/31(水)
中川

pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理をした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。
ddH2O2 µl
BBa_E024050 µl
EcoRⅠ1 µl
Pst1 µl
10 x H Buffer6 µl
 total 60 µl

制限酵素処理後、100 V 30minで電気泳動した。
【結果】
泳動後の写真