Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNote/GFPMLF9J

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９月１日

Member

中川

1.QIAquick Gel Extraction Kitを使用してゲルからpSB1C3のDNAを抽出し、濃度を測定した。

2.8/30に再設計したプライマーを用いて以下の条件でBBa_E0240のPCRを行った。

PCR条件 10 µM GFP Primer F 1.5 µl 10 µM GFP Primer R 1.5 µl BBa_E0240 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 95°C 30sec   Denature 95°C 30sec 30 Cycle Anneling 50°C 1min Extension 68°C 1min End 4°C keep

Results

1.泳動後の写真

約2kbのところにバンドが見られた。

抽出したゲルのうち5 µlを20倍希釈し、吸光計で濃度測定をした。

1回目	0.019
2回目	0.013
3回目	0.019
4回目	0.022
5回目	0.016
ave.	0.0178

濃度は17.8ng/µlと算出された。

2.９月２日に続く

９月２日

Member

中川

昨日のBBa_E0240のPCR産物のフェノールクロロホルム処理、PCR産物の増幅を確認するための電気泳動、PCR産物の制限酵素処理を行った。

制限酵素処理は、下記の表に従って反応液を調整し、37°Cでインキュベートした。(overnight)

Results

泳動後の写真

PCR産物の増幅が確認できた。

９月３日

Member

中川

Results

９月５日

Member

中川

Results

コロニーは全く生えていなかった。

インサートとベクターの量に注意して再度ライゲーションを行う。

９月６日

Member

吉村、中川

Results

4つのコロニーが確認できた。

９月６日

Member

吉村

pSB1C3のトランスフォーメーション

Results

小さいコロニーの生育がみられた。

９月７日

Member

吉村、中川

pSB1C3のプレカルチャー(6サンプル)

Results

6サンプルのうち3サンプルは培養に成功した。

3サンプルはコンタミの可能性があるため、念を入れて翌日もプレカルチャーを行うことにした。

９月８日

Member

中川

1.pSB1C3のプレカルチャー(6サンプル)

2.プライマーの再設計

Results

1.コンタミすることなく培養に成功した。

2.以下のように設計した。

F: 3' TTGAATTCTTTTCTAGATTTCGTAAAGGAGAAGAA

　　　　　 　　 EcoRⅠ　 　　XbaⅠ

Tm値:68.8゜C　　35塩基

８月３１日

Member

中川

pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理をした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。

ddH2O	2 µl
BBa_E0240	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

制限酵素処理後、100 V 30minで電気泳動を行った。

Results

泳動後の写真

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