Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNote/GFPMLF9J

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９月１日

Member

中川

1.QIAquick Gel Extraction Kitを使用してゲルからpSB1C3のDNAを抽出し、濃度を測定した。

2.8/30に再設計したプライマーを用いて以下の条件でBBa_E0240のPCRを行った。

PCR条件 10 µM GFP Primer F 1.5 µl 10 µM GFP Primer R 1.5 µl BBa_E0240 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 95°C 30sec   Denature 95°C 30sec 30 Cycle Anneling 50°C 1min Extension 68°C 1min End 4°C keep

Results

1.泳動後の写真

約2kbのところにバンドが見られた。

抽出したゲルのうち5 µlを20倍希釈し、吸光計で濃度測定をしたところ、濃度は17.8ng/µlと算出された。

1回目	0.019
2回目	0.013
3回目	0.019
4回目	0.022
5回目	0.016
ave.	0.0178

2.９月２日に続く

９月２日

Member

中川

昨日のBBa_E0240のPCR産物のフェノールクロロホルム処理、PCR産物の増幅を確認するための電気泳動、PCR産物の制限酵素処理を行った。

制限酵素処理は、下記の表に従って反応液を調整し、37°Cでインキュベートした。(overnight)

Results

泳動後の写真

PCR産物の増幅が確認できた。

９月３日

Member

中川

QIAquick Gel Extraction Kitを使用して制限酵素処理済みのBBa_E0240をゲル抽出した。

Results

９月５日

Member

中川

下表に従ってpSB1C3(19 ng/µl)とBBa_E0240(noATG GFP25 ng/µl)のライゲーションを行った。

BBa_E0240	0.5 µl
pSB1C3	0.5 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH2O	1.0 µl
	total 5 µl

16°C、30minでincubateした後、形質転換を行った。

Results

コロニーは全く生えていなかった。

インサートとベクターの量に注意して再度ライゲーションを行う。

９月６日

Member

吉村、中川

Results

4つのコロニーが確認できた。

９月７日

Member

中川

Results

９月８日

Member

中川

Results

９月９日

Member

中川

Results

９月１２日

Member

吉村、中川

Results

９月１３日

Member

吉村、中川

Results

９月１４日

Member

吉村、中川

1.PCRでFlag-MLFが増幅しているかを調べるため電気泳動を行った。

2.pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理、制限酵素処理

Results

泳動後の写真

ゲルの濃度を2倍にしたところ、マーカーが流れなかったので、Flag-tag MLFの電気泳動に関しては今後、2%のアガロースゲルで行うこととする。