Team:KIT-Kyoto/GFP-MLF実験かんたん

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Latest revision as of 05:22, 3 October 2011

8/22(月)
吉村、中川、松浪

・BBa_E0240のトランスフォーメーション
【結果】
コロニーの生育がみられた。

8/23(火)
吉村、中川

・BBa_E0240のプレカルチャー

【結果】
全てのサンプルに大腸菌の増殖がみられた。

・BBa_E0240からno ATG GFPを作るため以下のようにプライマー設計をした。

F: 3' TTGAATTCTTTCTAGATTCGTAAAGGAGAAGAA
　　　　　EcoRⅠ　　　　XbaⅠ
Tm値:67.75゜C　　33塩基

R: 5' AAACTGCAGAAAACTAGTTTTTTATTATTTGTATAG
　　　　　 PstⅠ　　　　　SpeⅠ
Tm値:67.66゜C　　36塩基

8/24(水)　11:00～
吉村、中川

BBa_E0240のアルカリミニプレップをした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。

ddH₂O	2 µl
BBa_E0240	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

制限酵素処理後、100 V 30minで電気泳動した。
【結果】
泳動後の写真

800bpあたりにバンドが出ていた。

8/25(木)　11:00～
吉村、中川

8/23に設計したプライマーを用いて、以下の条件でPCRを行った。

PCR条件

10 µM GFP Primer F	1.5 µl
10 µM GFP Primer R	1.5 µl
BBa_E0240	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	4 µl
MgSO₄	4 µl
ddH₂O	32 µl
KOD Plus	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Start	95°C、30秒
Cycle x 30	95°C、30秒(熱変性)
	50°C、1分(アニーリング)
	68°C、1kb/分(伸長)
End	4°Cで保持

PCR産物が増幅していることを確認するため、アガロース電気泳動を行った。

泳動後の写真

800bpあたりにバンドが見られ、PCR産物の増幅が確認できた。

PCR産物の増幅を確認した後、下表に従ってPCR産物の制限酵素処理を行った。(37゜C、overnight)。

ddH₂O	2 µl
BBa_E0240	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

8/26(金)
中川　17:00～

・ゲルからのDNA抽出

ゲル切り出し後の写真

濃度は510 ng/µlだった。

・pSB1C3のトランスフォーメーション

【結果】
小さいが、コロニーが生えていた。
念のために、翌日再度トランスフォーメーションをする。

8/27(土)
吉村

pSB1C3のトランスフォーメーション

【結果】
小さいコロニーの生育がみられた。

8/29(月)
中川
・pSB1C3のプレカルチャーを6サンプル行った。

【結果】
6サンプルのうち3サンプルは培養に成功したが、3サンプルはコンタミの可能性があるため、念を入れて翌日もプレカルチャーを行うことにした。

8/30(火)
中川
大会提出用ベクターpSB1C3のプレカルチャーを6サンプル行った。

【結果】
コンタミすることなく培養に成功した。

・8/23に設計したプライマーだと、フレームシフトをおこしている可能性があったため、プライマーの再設計を行った。
F: 3' TTGAATTCTTTTCTAGATTTCGTAAAGGAGAAGAA
　　　　　EcoRⅠ　　　　XbaⅠ
Tm値:68.8゜C　　35塩基

8/31(水)
中川

pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理をした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。

ddH₂O	2 µl
BBa_E0240	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

制限酵素処理後、100 V 30minで電気泳動した。
【結果】
泳動後の写真

@@ Line 30: / Line 30: @@
 ・BBa_E0240からno ATG GFPを作るため以下のようにプライマー設計をした。<br>
 <br>
-<span style="FONT-FAMILY: 'ArialMT','sans-serif'; mso-hansi-font-family: ArialMT; mso-bidi-font-family: 'Times New Roman'" lang="EN-US"> F: 3' TT<span style="COLOR: red">GAATTC</span>TT<span style="COLOR: red">TCTAGA</span>TT
+<span style="FONT-FAMILY: 'ArialMT','sans-serif'; mso-hansi-font-family: ArialMT; mso-bidi-font-family: 'Times New Roman'" lang="EN-US"> F: 3' TT<span style="COLOR: red">GAATTC</span>TT<span style="COLOR: red">TCTAGA</span>TTCGTAAAGGAGAAGAA<br>
-CGTAAAGGAGAAGAA<br>
 　　　　　<em>Eco</em>RⅠ　　　　<em>Xba</em>Ⅰ<br>
 Tm値:67.75゜C　　33塩基<br>
@@ Line 79: / Line 78: @@
 吉村、中川<br>
 <br>
-PCR<br>
+/23に設計したプライマーを用いて、以下の条件でPCRを行った。<BR>
-<br>
-以下の条件でPCRを行った。<BR>
 <table border="0"><tr><td>
 <table border="0" width="150px">
@@ Line 89: / Line 86: @@
 <tr><td width="150px" align=center>10 µM GFP Primer F</td><td width="100px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>10 µM GFP Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
-<tr><td align=center>鋳型 DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+<tr><td align=center>BBa_E0240</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>10 x PCR Buffer for KOD Plus</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>4 µl</td></tr>
@@ Line 95: / Line 92: @@
 <tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>32 µl</td></tr>
 <tr><td align=center>KOD Plus</td><td align=right>1 µl</td></tr>
-<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>全量 50 µl</td></tr>
+<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 </table>
 </td><TD></TD><TD></TD><td>
@@ Line 104: / Line 101: @@
 <tr><td width="100px" align=center>Start</td><td width="200px"  align=right>95°C、30秒</td></tr>
 <tr><td align=center rowspan=3>Cycle x 30</td><td align=right>95°C、30秒(熱変性)</td></tr>
-<tr><td align=right>(Tm-5)°C、1分(アニーリング)</td></tr>
+<tr><td align=right>50°C、1分(アニーリング)</td></tr>
 <tr><td align=right>68°C、1kb/分(伸長)</td></tr>
 <tr><td align=center>End</td><td align=right>4°Cで保持</td></tr>
@@ Line 115: / Line 112: @@
 <BR>
 <BR>
-【結果】<BR>
 泳動後の写真<BR>
 <IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/1/16/2011.08.25_GFP.JPG" width="250px" height="250px" border="0">
@@ Line 123: / Line 119: @@
 <br>
 <br>
+PCR産物の増幅を確認した後、下表に従ってPCR産物の制限酵素処理を行った。(37゜C、overnight)。<BR>
-<BR>
-★何のDNAかなぞ★<BR>
-フェノクロ処理<BR>
-↓前回泳動した残りサンプルを合わせて135μlにした<BR>
-↓ddH<sub>2</sub>O65μl加えて全量を200μlにした<BR>
-↓フェノール/クロロホルムを等量入れた<BR>
-↓しっかりvoltexして、15000rpm,5分,25℃で遠心した<BR>
-↓水層を別のエッペンに入れた（下の層がフェノール層）<BR>
-↓次にクロロホルムのみで同様におこない、水層を別のエッペンに移した<BR>
-↓1/10等量の3M酢酸ナトリウムを加えた<BR>
-↓等量のイソプロパノールを加え、よく振った<BR>
-↓12000rpm,20分25℃で遠心した<BR>
-↓沈殿をとらないように上澄みだけ除いた<BR>
-↓70%エタノールを200μl加えた<BR>
-↓軽く混ぜた後12000rpm,10分,25℃で遠心<BR>
-↓上澄みを除いた後乾燥させて長期保存ならTE、すぐに使うのでddH<sub>2</sub>O50μlに溶かした<BR>
-<BR>
-<BR>
-<BR>
-制限酵素処理<br>
-【目的】<br>
-提出用ベクターに組み込むインサートの調整<br>
-<br>
-【実験方法】<br>
-下表に従って、制限酵素処理を行った。<BR>
 <tr><td><table border=1 width="220px">
@@ Line 159: / Line 129: @@
 <tr><td align=center>&nbsp;</td><td align=right>total 60 µl</td></tr>
 </table>
-<br>
-゜Cでインキュベートした(overnight)。
 <BR>
 <BR>
@@ Line 173: / Line 142: @@
 中川　17:00～<br>
 <BR>
-ゲルからのDNA抽出<br>
+・ゲルからのDNA抽出<br>
 <br>
-【結果】<br>
-</span></span>濃度は510
-ng/&micro;lだった。<br>
-<BR>
 ゲル切り出し後の写真<BR>
 <IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/c/ce/8.26GFP%E3%82%B2%E3%83%AB%E6%8A%BD.jpg" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+<br>
+濃度は510 ng/µlだった。<br>
 <BR>
 <BR>
-pSB1C3のトランスフォーメーション<br>
+<BR>
+・pSB1C3のトランスフォーメーション<br>
 <br>
 【結果】<br>
@@ Line 210: / Line 175: @@
 <BR>
 <BR>
+<BR>
-★謎！！！★<BR>
 /29(月)<BR>
+中川<BR>
-pSB1C3のプレカルチャー<BR>
+・pSB1C3のプレカルチャーを6サンプル行った。<BR>
-【実験方法】<BR>
-/26に培養した提出用ベクターのコロニーの生えたプレートを用いた<BR>
-↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養した<BR>
-↓プレートからシングルコロニーを分離した<BR>
-↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養した<BR>
 <BR>
 【結果】<BR>
-翌日コンタミしてると考えられるビン3本培養に成功したビンが3本できた<BR>
+サンプルのうち3サンプルは培養に成功したが、3サンプルはコンタミの可能性があるため、念を入れて翌日もプレカルチャーを行うことにした。<BR>
-ただ念を入れて翌日同じ操作を行うことにした。<BR>
 <BR>
 <BR>
 <BR>
-<BR>
-<BR>
-★実験内容が謎…泳動の写真があるのになぜ電気泳動の記述がない？しかも過去形にしてない★<BR>
 /30(火)<BR>
-(目的)<BR>
+中川<BR>
-大会提出用ベクターpsb1c3の培養→トラフォ(二回目)
+大会提出用ベクターpSB1C3のプレカルチャーを6サンプル行った。<BR>
-(方法)<BR>
-/26に培養した提出用ベクターのコロニーの生えたプレートを昨日同様用いた<BR>
-↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養する<BR>
-↓プレートからシングルコロニーを分離する<BR>
-↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養する<BR>
 <BR>
-(結果)<BR>
+【結果】<BR>
-翌日6本培養したがコンタミすることなく無事に大腸菌を回収することができた<BR>
+コンタミすることなく培養に成功した。<BR>
 <BR>
 <BR>
+・8/23に設計したプライマーだと、フレームシフトをおこしている可能性があったため、プライマーの再設計を行った。
 <BR>
+<span style="FONT-FAMILY: 'ArialMT','sans-serif'; mso-hansi-font-family: ArialMT; mso-bidi-font-family: 'Times New Roman'" lang="EN-US"> F: 3' TT<span style="COLOR: red">GAATTC</span>TTT<span style="COLOR: red">TCTAGA</span>TTTCGTAAAGGAGAAGAA<br>
+　　　　　<em>Eco</em>RⅠ　  　　　<em>Xba</em>Ⅰ<br>
+Tm値:68.8゜C　　35塩基<br>
+<BR><BR>
 <BR>
 <BR>
 <BR>
 <BR>
+/31(水)<BR>
+中川<BR>
 <BR>
-★実験内容が謎…ミニプレの記述しかないし、何のDNAかもわからない★<BR>
+pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理をした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。<BR>
-/31(水)<BR>
-(目的)<BR>
+<tr><td><table border=1 width="220px">
-培養した菌液のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理、電気泳動、制限酵素処理<BR>
+<tr><td width="130px" align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td width="90px"  align=right>2 µl</td></tr>
-アルカリミニプレを最初に行った。<BR>
+<tr><td align=center>BBa_E0240</td><td align=right>50 µl</td></tr>
-<tr><td><table border=1 width="280px">
+<tr><td align=center><em>Eco</em>RⅠ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
-<tr><td width="80px" align=center>Solution I</td><td width="200px"  align=right>50 mM グルコース (MW 180)</td></tr>
+<tr><td align=center><em>Pst</em>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
-<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>10 mM EDTA(pH 8.0)</td></tr>
+<tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>6 µl</td></tr>
-<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>25 mM Tris-HCl (pH 8.0)</td></tr>
+<tr><td align=center>&nbsp;</td><td align=right>total 60 µl</td></tr>
-<tr><td align=center>Solution II</td><td align=right>0.2 N NaOH</td></tr>
-<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>1% SDS</td></tr>
-<tr><td align=center>Solution III</td><td align=right>3 M 酢酸カリウム</td></tr>
-<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>1.8 M 酢酸</td></tr>
 </table>
+<br>
+制限酵素処理後、100 V 30minで電気泳動した。
-↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養する<BR>
+<BR>
-↓プレートからシングルコロニーを分離する<BR>
+【結果】<BR>
-↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養する<BR>
+泳動後の写真<BR>
-↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4°Cで5分間遠心し、上清を捨てる<BR>
+<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/f/f2/2011.08.31.JPG" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
-↓100 µlの氷冷したSolution Iを加え、ボルテックスする<BR>
+<BR>
-↓沈殿物を溶かした後、200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない<BR>
-↓氷上で5分間冷やす<BR>
-↓150 µlのSolution IIIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない<BR>
-↓氷上で5分間冷やす<BR>
-↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心する<BR>
-↓上清を新しいチューブにとり、沈殿物は廃棄する<BR>
-↓450 µlのイソプロパノールを加え、混ぜる<BR>
-↓2分間室温で放置する<BR>
-↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる<BR>
-↓150～200 µlの70%エタノールを加え、軽くボルテックスする<BR>
-↓2分間室温で放置する<BR>
-↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる<BR>
-↓沈殿を10分～15分乾かす<BR>
-↓RNaseのはいったTEを20 µl加えて37°Cで培養する<BR>
 <BR>
-</span></font>
 </p>
 </body>
 </html>