Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNote/GFPMLF9J

From 2011.igem.org

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<div id=NAKAMI>
<div id=NAKAMI>
{| style="color:#000080;background-color:transparent;" cellpadding="3" cellspacing="1" border="0" bordercolor="#0000FF" width="900px" align="center"
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:中川
:中川
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:1.<html><body><a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a></body></html>を使用してゲルからpSB1C3のDNAを抽出し、濃度を測定した。
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:1.[http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx QIAquick Gel Extraction Kit]を使用してゲルからpSB1C3のDNAを抽出し、濃度を測定した。
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:2.8/30に再設計したプライマーを用いて以下の条件でBBa_E0240のPCRを行った。
:2.8/30に再設計したプライマーを用いて以下の条件でBBa_E0240のPCRを行った。
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:<table border="0"><tr><td>
:<table border="0"><tr><td>
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:抽出したゲルのうち5 µlを20倍希釈し、吸光計で濃度測定をした。<BR>
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:抽出したゲルのうち5 µlを20倍希釈し、吸光計で濃度測定をしたところ、濃度は17.8ng/µlと算出された。<BR>
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:濃度は17.8ng/µlと算出された。<BR>
 
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:2.9月2日に続く<BR>
:2.9月2日に続く<BR>
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:中川
:中川
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:[http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx QIAquick Gel Extraction Kit]を使用して制限酵素処理済みのBBa_E0240をゲル抽出した。<BR>
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<b>Results</b>
<b>Results</b>
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:<html><body>
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<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/b/bb/2011.09.03_%E4%B8%AD%E5%B7%9D%E3%82%B2%E3%83%AB%E6%8A%BD%E5%87%BA.JPG" width="250px" height="250px" border="0">
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:中川<br>
:中川<br>
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:下表に従ってpSB1C3(19 ng/µl)とBBa_E0240(noATG GFP、25 ng/µl)のライゲーションを行った。<BR>
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:<table border=1 width="200px">
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:<tr><td width="130px" align=center>BBa_E0240</td><td width="70px" align=right>0.5 µl</td></tr>
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:<tr><td align=center>10 x Buffer</td><td align=right>2.5 µl</td></tr>
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:<tr><td align=center>F4 ligase</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
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:<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>1.0 µl</td></tr>
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:<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 5 µl</td></tr>
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:</table>
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:16°C、30minでincubateした後、形質転換を行った。<BR>
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:吉村、中川<br>
:吉村、中川<br>
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:
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:1.ベクターとインサートの濃度比を1:9にして昨日と同様にライゲーションを行った。
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:2.Flag-tag dMLFのプライマー設計
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<b>Results</b>
<b>Results</b>
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:4つのコロニーが確認できた。
+
:1.翌日、4つのコロニーが確認できた。
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:2.F:AAA<font color="#ff0000">GAATTC</font>AAA<font color="#ff0000">TCTAGA</font>AAAATGGACTACAAGGACGA<br>
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:           <em>Eco</em>RⅠ  <em>Xba</em>Ⅰ<br>
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:Tm値:72.14℃ 38塩基<br>
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:R:AAA<font color="#ff0000">CTGCAG</font>AAA<font color="#ff0000">ACTAGT</font>AAATACCCTACTTCTTCTTGCC<br>
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:     <em>Pst</em>Ⅰ   <em>Spe</em>Ⅰ<br>
 +
:Tm値:72.16℃ 40塩基<br>
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:中川
:中川
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:
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:1.昨日ライゲーションしてできたコロニーのプレカルチャー<BR>
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:2.pSB1C3のプレカルチャー<BR>
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:3.以下のプログラムでFlag-tag dMLFのPCRを行った。
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:<table border="0"><tr><td>
 +
:<table border="0" width="150px">
 +
:<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
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:</table>
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:<table border=1 width="250px">
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:<tr><td width="150px" align=center>10 µM GFP Primer F</td><td width="100px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
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:<tr><td align=center>10 µM GFP Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>Flag tag dMLF</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>10 x PCR Buffer for KOD Plus</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>4 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>MgSO<sub>4</sub></td><td align=right>4 µl</td></tr>
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:<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>32 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>KOD Plus</td><td align=right>1 µl</td></tr>
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:<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 +
:</table>
 +
:</td><TD></TD><TD></TD><td>
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:<table border="0" width="100px">
 +
:<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
 +
:</table>
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:<table border=1 width="400px">
 +
:<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px" align=center>95°C</td><td width="100px" align=center>30sec</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>95°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>30 Cycle</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50°C</td><td align=center>1min</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1min</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
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:</table>
 +
:</td></tr>
 +
:</table>
 +
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 +
:下表に従ってPCR産物の制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)<BR>
 +
:<table border=1 width="220px">
 +
:<tr><td width="130px" align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td width="90px"  align=right>2 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>Flag-tag dMLF</td><td align=right>50 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center><em>Eco</em>RⅠ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center><em>Pst</em>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>6 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>&nbsp;</td><td align=right>total 60 µl</td></tr>
 +
:</table>
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<b>Results</b>
<b>Results</b>
:
:
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:中川
:中川
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-
:
+
:1.Flag tag dMLFのゲル抽出
 +
:2.pSB1C3のアルカリミニプレップをした後、フェノールクロロホルム処理をした後、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
 +
:<table border=1 width="220px">
 +
:<tr><td width="130px" align=center>pSB1C3in ddH<sub>2</sub>O</td><td width="90px"  align=right>50 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center><em>EcoR</em>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center><em>Pst</em>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>6 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>&nbsp;</td><td align=right>total 58 µl</td></tr>
 +
:</table>
 +
:37°Cで20時間静置した。
<br>
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<b>Results</b>
<b>Results</b>
-
:
+
:1.MLFを切り出すときにほとんどバンドは見えなかった。
 +
:そこでまずはベクターとGFPのライゲーションに明日から力を入れることにした。
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:中川<br>
:中川<br>
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-
:
+
:ベクターとGFPのライゲーションのためのエタノール沈殿
-
<br>
+
:エタノール沈殿をすることでベクターとGFPの濃度をあげ、ライゲーションの効率を上げる<BR>
 +
<BR><BR>
<b>Results</b>
<b>Results</b>
-
:
+
:エタノール沈殿に失敗し沈殿すべきDNAが見当たらず濃度を濃く出来なくなった。
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-
==''8月31日''==
+
==''9月12日''==
<b>Member</b>
<b>Member</b>
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-
:中川<br>
+
:吉村、中川<br>
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-
:pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理をした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。
+
:9/6に作製したプライマーを用いて、Flag-tag dMLFについて以下の2条件で各1サンプルずつPCRを行った。
-
:<table border=1 width="220px">
+
:<table border="0"><tr><td>
-
:<tr><td width="130px" align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td width="90px"  align=right>2 µl</td></tr>
+
:<table border="0" width="150px">
-
:<tr><td align=center>BBa_E0240</td><td align=right>50 µl</td></tr>
+
:<tr><td align=center>PCR条件(1)</td></tr>
-
:<tr><td align=center><em>Eco</em>RⅠ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+
:</table>
-
:<tr><td align=center><em>Pst</em></td><td align=right>1 µl</td></tr>
+
:<table border=1 width="250px">
-
:<tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>6 µl</td></tr>
+
:<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="100px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
-
:<tr><td align=center>&nbsp;</td><td align=right>total 60 µl</td></tr>
+
:<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>10 x PCR Buffer for KOD Plus</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>4 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>MgSO<sub>4</sub></td><td align=right>4 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>32 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>KOD Plus</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
:<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 +
:</table>
 +
:</td><TD></TD><TD></TD><td>
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:<table border="0" width="100px">
 +
:<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
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:</table>
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:<table border=1 width="400px">
 +
:<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px" align=center>2min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>55°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1min 20sec</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
:</table>
 +
:</td></tr>
:</table>
:</table>
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-
:制限酵素処理後、100 V 30minで電気泳動を行った。
+
:<table border="0"><tr><td>
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:<table border="0" width="150px">
 +
:<tr><td align=center>PCR条件(2)</td></tr>
 +
:</table>
 +
:<table border=1 width="250px">
 +
:<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="100px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>10 x PCR Buffer for KOD Plus</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>4 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>MgSO<sub>4</sub></td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>34 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>KOD Plus</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
:<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
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:</table>
 +
:</td><TD></TD><TD></TD><td>
 +
:<table border="0" width="100px">
 +
:<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
 +
:</table>
 +
:<table border=1 width="400px">
 +
:<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px" align=center>2min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>55°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1min 20sec</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
:</table>
 +
:</td></tr>
 +
:</table>
 +
 
 +
:各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。
 +
 
 +
 
 +
 
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<b>Results</b>
<b>Results</b>
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:泳動後の写真<BR>
+
:
-
:<html><body>
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<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/f/f2/2011.08.31.JPG" width="250px" height="250px" border="0">
+
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</body></html>
+
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==''9月13日''==
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<b>Member</b>
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:吉村、中川<br>
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:
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<b>Results</b>
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:
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 +
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==''9月14日''==
 +
<b>Member</b>
 +
<br>
 +
:吉村、中川<br>
 +
<br>
 +
:1.PCRでFlag-MLFが増幅しているかを調べるため電気泳動を行った。
 +
:2.pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理、制限酵素処理
 +
 +
 +
<br>
 +
<b>Results</b>
 +
:泳動後の写真<BR>
 +
:<html><body><IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/5/53/2011.09.14MLF-PCR%E3%83%81%E3%82%A7%E3%83%83%E3%82%AF.JPG
 +
" width="240px" height="280px" border="0"></body></html>
 +
<BR>
 +
:ゲルの濃度を2倍にしたところ、マーカーが流れなかったので、Flag-tag MLFの電気泳動に関しては今後、2%のアガロースゲルで行うこととする。<BR>
</div>
</div>

Latest revision as of 00:21, 6 October 2011



Home Team Project Parts Notebook Safety Human Practice Attributions


Home > Notebook > Lab Note > September Language:English/Japanese

9月1日

Member

中川


1.[http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx QIAquick Gel Extraction Kit]を使用してゲルからpSB1C3のDNAを抽出し、濃度を測定した。
2.8/30に再設計したプライマーを用いて以下の条件でBBa_E0240のPCRを行った。


PCR条件
10 µM GFP Primer F1.5 µl
10 µM GFP Primer R1.5 µl
BBa_E02401 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs4 µl
MgSO44 µl
ddH2O32 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature95°C30sec 
Denature95°C30sec30 Cycle
Anneling50°C1min
Extension68°C1min
End4°Ckeep 




Results

1.泳動後の写真

約2kbのところにバンドが見られた。


抽出したゲルのうち5 µlを20倍希釈し、吸光計で濃度測定をしたところ、濃度は17.8ng/µlと算出された。


1回目0.019
2回目0.013
3回目0.019
4回目0.022
5回目0.016
ave.0.0178



2.9月2日に続く


9月2日

Member

中川


昨日のBBa_E0240のPCR産物のフェノールクロロホルム処理、PCR産物の増幅を確認するための電気泳動、PCR産物の制限酵素処理を行った。
制限酵素処理は、下記の表に従って反応液を調整し、37°Cでインキュベートした。(overnight)



Results

泳動後の写真


PCR産物の増幅が確認できた。


9月3日

Member

中川


[http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx QIAquick Gel Extraction Kit]を使用して制限酵素処理済みのBBa_E0240をゲル抽出した。


Results



9月5日

Member

中川


下表に従ってpSB1C3(19 ng/µl)とBBa_E0240(noATG GFP、25 ng/µl)のライゲーションを行った。


BBa_E02400.5 µl
pSB1C30.5 µl
10 x Buffer2.5 µl
F4 ligase0.5 µl
ddH2O1.0 µl
 total 5 µl


16°C、30minでincubateした後、形質転換を行った。



Results

コロニーは全く生えていなかった。
インサートとベクターの量に注意して再度ライゲーションを行う。


9月6日

Member

吉村、中川


1.ベクターとインサートの濃度比を1:9にして昨日と同様にライゲーションを行った。
2.Flag-tag dMLFのプライマー設計


Results

1.翌日、4つのコロニーが確認できた。
2.F:AAAGAATTCAAATCTAGAAAAATGGACTACAAGGACGA
      EcoRⅠ  Xba
Tm値:72.14℃ 38塩基
R:AAACTGCAGAAAACTAGTAAATACCCTACTTCTTCTTGCC
     PstⅠ   Spe
Tm値:72.16℃ 40塩基


9月7日

Member

中川


1.昨日ライゲーションしてできたコロニーのプレカルチャー
2.pSB1C3のプレカルチャー
3.以下のプログラムでFlag-tag dMLFのPCRを行った。
PCR条件
10 µM GFP Primer F1.5 µl
10 µM GFP Primer R1.5 µl
Flag tag dMLF1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs4 µl
MgSO44 µl
ddH2O32 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature95°C30sec 
Denature95°C30sec30 Cycle
Anneling50°C1min
Extension68°C1min
End4°Ckeep 


下表に従ってPCR産物の制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
ddH2O2 µl
Flag-tag dMLF50 µl
EcoRⅠ1 µl
Pst1 µl
10 x H Buffer6 µl
 total 60 µl


Results


9月8日

Member

中川


1.Flag tag dMLFのゲル抽出
2.pSB1C3のアルカリミニプレップをした後、フェノールクロロホルム処理をした後、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
pSB1C3in ddH2O50 µl
EcoR1 µl
Pst1 µl
10 x H Buffer6 µl
 total 58 µl
37°Cで20時間静置した。


Results

1.MLFを切り出すときにほとんどバンドは見えなかった。
そこでまずはベクターとGFPのライゲーションに明日から力を入れることにした。


9月9日

Member

中川


ベクターとGFPのライゲーションのためのエタノール沈殿
エタノール沈殿をすることでベクターとGFPの濃度をあげ、ライゲーションの効率を上げる



Results

エタノール沈殿に失敗し沈殿すべきDNAが見当たらず濃度を濃く出来なくなった。



9月12日

Member

吉村、中川


9/6に作製したプライマーを用いて、Flag-tag dMLFについて以下の2条件で各1サンプルずつPCRを行った。
PCR条件(1)
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs4 µl
MgSO44 µl
ddH2O32 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling55°C30sec
Extension68°C1min 20sec
End4°Ckeep 


PCR条件(2)
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs4 µl
MgSO42 µl
ddH2O34 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling55°C30sec
Extension68°C1min 20sec
End4°Ckeep 
各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。




Results


9月13日

Member

吉村、中川



Results


9月14日

Member

吉村、中川


1.PCRでFlag-MLFが増幅しているかを調べるため電気泳動を行った。
2.pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理、制限酵素処理



Results

泳動後の写真


ゲルの濃度を2倍にしたところ、マーカーが流れなかったので、Flag-tag MLFの電気泳動に関しては今後、2%のアガロースゲルで行うこととする。