Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNote/DIAP2-MALT9
From 2011.igem.org
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- | :<tr><td align="center"> | + | :<tr><td align="center">PCR reaction</td></tr> |
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- | :<tr><td align="center"> | + | :<tr><td align="center">Cycle</td></tr> |
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:Yokoigawa, Takeda | :Yokoigawa, Takeda | ||
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- | :The restriction enzyme-digested PCR fragments and pUAST-flag DNA were extracted from the agarose gel by[http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx QIAquick Gel Extraction Kit] | + | :The restriction enzyme-digested PCR fragments and pUAST-flag DNA were extracted from the agarose gel by[http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx QIAquick Gel Extraction Kit]. |
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<b>Results</b> | <b>Results</b> |
Revision as of 17:56, 5 October 2011
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1st, September
Member
- Takeda
- Again different annealing conditions were tested.
PCR reaction 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl or 4 µl ddH2O 33 µl or 31 µl KOD+ polymelase 1 µl total 50 µl Cycle Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 15sec 35 Cyle Anneling 50.5°C 30sec Extension 68°C 100sec End 4°C keep
- PCR products were applied to the agarose gel electrophoresis.
Results
- Image of the agarose gel.
-
5th, September
Member
- Yokoigawa, Takeda
- The PCR products for DIAP2 was treated wit phenol-chloroform and then digested with the XhoI for 20 hours at 37°C.
DIAP2 PCR reaction in ddH2O 44 μl 10 x H Buffer 5 μl XhoⅠ 1 μl total 50 μl
6th, September
Member
- Yokoigawa, Takeda
- The PCR products for DIAP2 was treated wit phenol-chloroform and then digested with the XbaI for 20 hours at 37°C.
DIAP2 PCR reaction in ddH2O 44 μl 10 x M Buffer 5 μl XbaⅠ 1 μl total 50 μl
7th, September
Member
- Yokoigawa, Takeda
- The restriction enzyme-digested PCR fragments and pUAST-flag DNA were extracted from the agarose gel by[http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx QIAquick Gel Extraction Kit].
Results
- PCR products for DIAP2 Was not successfully recovered from the agarose gel.
12th, September
Member
- Matsunami, Yokoigawa
- To amplify DIAP2 cDNA, PCR reactions were carried out by using the following primers and under the following conditions.
- F primer GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
- Tm value 62 °C
- R primer GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
- Tm value 66.4°C
- amplicon size 1514 bp
PCR reaction 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl ddH2O 33 µl KOD+ polymelase 1 µl total 50 µl Cycle Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 50.5°C 30sec Extension 68°C 1min40sec End 4°C keep
- Again different annealing conditions were tested.
- Annealing 50.5°C
13th, September
Member
- Matsunami, Yokoigawa
- PCR products on 12th September were applied to the agarose gel electrophoresis.
Results
- Image of the agarose gel.
-
- Lane 1;DNA size marker(1 Kbp ladder)
- Lanes 2 and 3;DIAP2 cDNA
- Amplified DNA fragments were barely detectable for the DIAP2.
9月14日
Member
- 松浪、横井川
- API2-MALT1について以下のプライマーを用いて、以下の条件でPCRを行った。
- F primer GCCGCTCGAGACATAGTAGAAAACAGCAT
- Tm値 57.7 °C
- R primer GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
- Tm値 56.5 °C
- 増幅サイズ 約3131 bp
PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl total 20 µl Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 51.5°C 30sec Extension 72°C 3min20sec +Extension 72°C 10min End 4°C keep
- PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
Results
- 泳動後の写真
-
マーカー(1 Kbp)のみバンドが見られた。
9月15日
Member
- 松浪、横井川
- API2-MALT1、DIAP2について、以下の条件でPCRを行った。
- API2-MALT1
PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl total 20 µl Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 53°C 30sec Extension 72°C 3min20sec +Extension 72°C 10min End 4°C keep
- DIAP2
PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl ddH2O 33 µl KOD Plus 1 µl total 50 µl Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 50.5°C 30sec Extension 68°C 1min 40sec End 4°C keep
- PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
- DIAP2のPCR産物を、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2 PCR産物 in ddH2O 44 µl 10 x H Buffer 5 µl XhoⅠ 1 µl total 50 µl
37°Cで20時間静置した。
Results
- 泳動後の写真
-
- 左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2~5レーン;DIAP2、6~8レーン;API2-MALT1
- DIAP2に関しては予想される位置にバンドが見られたが、API2-MALT1は見られなかった。
9月16日
Member
- 松浪、横井川
- DIAP2のPCR産物を、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2 PCR産物 in ddH2O 44 µl 10 x M Buffer 5 µl XbaⅠ 1 µl total 50 µl
9月17日
Member
- 松浪、横井川
- 制限酵素処理を行ったDIAP2のプラスミドを確認するため、電気泳動を行った。
Results
- 泳動後の写真
-
- マーカー(1 Kbp)のバンドのみが見られた。制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなかった。
9月18日
Member
- 松浪
- コンピテントセル(DH5α)を作成した。
9月19日
Member
- 松浪
- コンピテントセル(DH5α)を作成した。
9月21日
Member
- 松浪
- 1.コンピテントセル(DH5α)を作成した。
- 2.DIAP2について、以下の条件でPCRを行った。
PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl ddH2O 33 µl KOD+ polymelase 1 µl total 50 µl Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 50.5°C 30sec Extension 68°C 1kb/min End 4°C keep
- PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
- DIAP2のPCR産物を、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2 |
PCR産物 in ddH2O | 44 µl |
10 x H Buffer | 5 µl |
XhoⅠ | 1 µl |
total 50 µl |
Results
- 1.ODを測定したが、OD=0.9を超えてしまった。
- 泳動後の写真
-
- 左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2~7レーン;DIAP2
- 全てのサンプルでPCRが成功した。
9月22日
Member
- 不明★
- DIAP2のPCR産物を、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2 PCR産物 in ddH2O 44 µl 10 x M Buffer 5 µl XbaⅠ 1 µl total 50 µl
9月23日
Member
- 松浪
- 制限酵素処理を行ったDIAP2のプラスミドを確認するため、電気泳動を行った。
Results
- 泳動後の写真
-
- マーカー(1 Kbp)のみバンドが見られ、制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなった。
9月25日
Member
- 松浪
- コンピテントセル(DH5α)を作成した。
9月27日
Member
- 松浪
- コンピテントセル(DH5α)を作成した。