Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNote/DIAP2-MALT9

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９月１日

Member

武田

DIAP2について、以下の条件でPCRを行った。

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl or 4 µl ddH2O 33 µl or 31 µl KOD+ polymelase 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cyle Anneling 50.5°C 30sec Extension 68°C 100sec End 4°C keep

PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。

Results

泳動後の写真

正しい位置にバンドが見られた。

９月５日

Member

横井川

1日に確認したDIAP2をフェノールクロロホルム処理し、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)

DIAP2

PCR産物 in ddH2O	44 μl
10 x H Buffer	5 μl
XhoⅠ	1 μl
	total 50 μl

37°Cで20時間静置した

９月６日

Member

横井川

1日に確認したDIAP2をフェノールクロロホルム処理し、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)

DIAP2

PCR産物 in ddH2O	44 μl
10 x M Buffer	5 μl
XbaⅠ	1 μl
	total 50 μl

37°Cで20時間静置した。

９月７日

Member

横井川

[http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx QIAquick Gel Extraction Kit]を使用してゲルからDIAP2のDNAを抽出した。

Results

バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。

12th, September

Member

Matsunami, Yokoigawa

To amplify DIAP2 cDNA, PCR reactions were carried out by using the following primers and under the following conditions.

F primer GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT

Tm value　　　　62 °C

R primer GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA

Tm value　　　　66.4°C

amplicon size　　1514 bp

PCR reaction 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl ddH2O 33 µl KOD+ polymelase 1 µl   total 50 µl

Cycle Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 50.5°C 30sec Extension 68°C 1min40sec End 4°C keep

Again different annealing conditions were tested.

Annealing 50.5°C

13th, September

Member

Matsunami, Yokoigawa

PCR products on 12th September were applied to the agarose gel electrophoresis.

Results

Image of the agarose gel.

Lane 1；DNA size marker（1 Kbp ladder）

Lanes 2 and 3；DIAP2 cDNA

Amplified DNA fragments were barely detectable for the DIAP2.

９月１４日

Member

松浪、横井川

API2-MALT1について以下のプライマーを用いて、以下の条件でPCRを行った。

F primer GCCGCTCGAGACATAGTAGAAAACAGCAT

Tm値　　　　57.8 °C

R primer GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA

Tm値　　　　56.5 °C

増幅サイズ　　約3131 bp

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 51.5°C 30sec Extension 72°C 3min20sec +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。

Results

泳動後の写真

マーカー（1 Kbp）のみバンドが見られた。

９月１５日

Member

松浪、横井川

API2-MALT1、DIAP2について、以下の条件でPCRを行った。

API2-MALT1

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 53°C 30sec Extension 72°C 3min20sec +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

DIAP2

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl ddH2O 33 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 50.5°C 30sec Extension 68°C 1min 40sec End 4°C keep

PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。

DIAP2のPCR産物を、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)

DIAP2

PCR産物 in ddH2O	44 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

37°Cで20時間静置した。
Results

泳動後の写真

左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～5レーン；DIAP2、6～8レーン；API2-MALT1

DIAP2に関しては予想される位置にバンドが見られたが、API2-MALT1は見られなかった。

９月１６日

Member

松浪、横井川

DIAP2のPCR産物を、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)

DIAP2

PCR産物 in ddH2O	44 µl
10 x M Buffer	5 µl
XbaⅠ	1 µl
	total 50 µl

９月１７日

Member

松浪、横井川

制限酵素処理を行ったDIAP2のプラスミドを確認するため、電気泳動を行った。

Results

泳動後の写真

マーカー（1 Kbp）のバンドのみが見られた。制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなかった。

９月１８日

Member

松浪

コンピテントセル（DH5α）を作成した。

９月１９日

Member

松浪

コンピテントセル（DH5α）を作成した。

９月２１日

Member

松浪

1.コンピテントセル（DH5α）を作成した。

2.DIAP2について、以下の条件でPCRを行った。

PCR条件 10 µM Primer F 1.5 µl 10 µM Primer R 1.5 µl Template DNA 1 µl 10 x PCR Buffer 5 µl dNTPs 5 µl MgSO4 2 µl ddH2O 33 µl KOD+ polymelase 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 15sec 35 Cycle Anneling 50.5°C 30sec Extension 68°C 1kb/min End 4°C keep

PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。

DIAP2のPCR産物を、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)

DIAP2

PCR産物 in ddH2O	44 µl
10 x H Buffer	5 µl
XhoⅠ	1 µl
	total 50 µl

Results

1.ODを測定したが、OD＝0.9を超えてしまった。

泳動後の写真

左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～7レーン；DIAP2

全てのサンプルでPCRが成功した。

９月２２日

Member

不明★

DIAP2のPCR産物を、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)

DIAP2

PCR産物 in ddH2O	44 µl
10 x M Buffer	5 µl
XbaⅠ	1 µl
	total 50 µl

９月２３日

Member

松浪

制限酵素処理を行ったDIAP2のプラスミドを確認するため、電気泳動を行った。

Results

泳動後の写真

マーカー（1 Kbp）のみバンドが見られ、制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなった。

９月２５日

Member

松浪

コンピテントセル(DH5α)を作成した。

９月２７日

Member

松浪

コンピテントセル(DH5α)を作成した。