Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNote/GFPMLF9J

９月１日

Member

中川

1.[http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx QIAquick Gel Extraction Kit]を使用してゲルからpSB1C3のDNAを抽出し、濃度を測定した。

2.8/30に再設計したプライマーを用いて以下の条件でBBa_E0240のPCRを行った。

PCR条件 10 µM GFP Primer F 1.5 µl 10 µM GFP Primer R 1.5 µl BBa_E0240 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 95°C 30sec   Denature 95°C 30sec 30 Cycle Anneling 50°C 1min Extension 68°C 1min End 4°C keep

Results

1.泳動後の写真

約2kbのところにバンドが見られた。

抽出したゲルのうち5 µlを20倍希釈し、吸光計で濃度測定をしたところ、濃度は17.8ng/µlと算出された。

1回目	0.019
2回目	0.013
3回目	0.019
4回目	0.022
5回目	0.016
ave.	0.0178

2.９月２日に続く

９月２日

Member

中川

昨日のBBa_E0240のPCR産物のフェノールクロロホルム処理、PCR産物の増幅を確認するための電気泳動、PCR産物の制限酵素処理を行った。

制限酵素処理は、下記の表に従って反応液を調整し、37°Cでインキュベートした。(overnight)

Results

泳動後の写真

PCR産物の増幅が確認できた。

９月３日

Member

中川

[http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx QIAquick Gel Extraction Kit]を使用して制限酵素処理済みのBBa_E0240をゲル抽出した。

Results

９月５日

Member

中川

下表に従ってpSB1C3(19 ng/µl)とBBa_E0240(noATG GFP、25 ng/µl)のライゲーションを行った。

BBa_E0240	0.5 µl
pSB1C3	0.5 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH2O	1.0 µl
	total 5 µl

16°C、30minでincubateした後、形質転換を行った。

Results

コロニーは全く生えていなかった。

インサートとベクターの量に注意して再度ライゲーションを行う。

９月６日

Member

吉村、中川

1.ベクターとインサートの濃度比を1:9にして昨日と同様にライゲーションを行った。

2.Flag-tag dMLFのプライマー設計

Results

1.翌日、4つのコロニーが確認できた。

2.F：AAAGAATTCAAATCTAGAAAAATGGACTACAAGGACGA

　　　　　 EcoRⅠ　　XbaⅠ

Tm値:72.14℃　38塩基

R：AAACTGCAGAAAACTAGTAAATACCCTACTTCTTCTTGCC

　　　　 PstⅠ　　　SpeⅠ

Tm値:72.16℃　40塩基

９月７日

Member

中川

1.昨日ライゲーションしてできたコロニーのプレカルチャー

2.pSB1C3のプレカルチャー

3.以下のプログラムでFlag-tag dMLFのPCRを行った。

PCR条件 10 µM GFP Primer F 1.5 µl 10 µM GFP Primer R 1.5 µl BBa_E0240 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 95°C 30sec   Denature 95°C 30sec 30 Cycle Anneling 50°C 1min Extension 68°C 1min End 4°C keep

下表に従ってPCR産物の制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)

ddH2O	2 µl
Flag-tag dMLF	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

Results

９月８日

Member

中川

Results

９月９日

Member

中川

ベクターとGFPのライゲーションのためのエタノール沈殿

(方法)

まずアドバイザーの方にどうしてライゲーションが失敗するのかを聞いてみた。すると以下の原因が考えられるとなった。

インサート、ベクターの濃度自体が薄すぎるのではないかという問題

そもそも抗生物質自体がうまく働いていないのではないか

制限酵素処理が完全にし切れていないのではないか

そこでエタノール沈殿をすることでベクターとGFPの濃度をあげることによりライゲーションの効率を上げることを画策した

Results

エタノール沈殿に失敗し沈殿すべきDNAが見当たらず濃度を濃く出来なくなった。

９月１２日

Member

吉村、中川

Results

９月１３日

Member

吉村、中川

Results

９月１４日

Member

吉村、中川

1.PCRでFlag-MLFが増幅しているかを調べるため電気泳動を行った。

2.pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理、制限酵素処理

Results

泳動後の写真

ゲルの濃度を2倍にしたところ、マーカーが流れなかったので、Flag-tag MLFの電気泳動に関しては今後、2%のアガロースゲルで行うこととする。