Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNote/GFPMLF9J

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:23日に作製したプライマーを用いて、以下の条件でPCRを行った。
 
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:<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
 
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:<table border=1 width="250px">
 
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:<tr><td width="150px" align=center>10 µM GFP Primer F</td><td width="100px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
 
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:<tr><td align=center>10 µM GFP Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
 
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:<tr><td align=center>BBa_E0240</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 
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:<tr><td align=center>10 x PCR Buffer for KOD Plus</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 
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:<tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>4 µl</td></tr>
 
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:<tr><td align=center>MgSO<sub>4</sub></td><td align=right>4 µl</td></tr>
 
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:<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>32 µl</td></tr>
 
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:<tr><td align=center>KOD Plus</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 
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:<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 
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:</table>
 
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:</td><TD></TD><TD></TD><td>
 
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:<table border="0" width="100px">
 
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:<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
 
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:</table>
 
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:<table border=1 width="400px">
 
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:<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px" align=center>95°C</td><td width="100px" align=center>30sec</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 
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:<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>95°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>30 Cycle</td></tr>
 
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:<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50°C</td><td align=center>1min</td></tr>
 
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:<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1min</td></tr>
 
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:<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 
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:</table>
 
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:</td></tr>
 
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:</table>
 
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:PCR産物が増幅していることを確認するため、アガロース電気泳動を行った。
 
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:PCR産物の増幅を確認した後、下表に従ってPCR産物の制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
 
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:<table border=1 width="220px">
 
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:<tr><td width="130px" align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td width="90px"  align=right>2 µl</td></tr>
 
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:<tr><td align=center>BBa_E0240</td><td align=right>50 µl</td></tr>
 
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:<tr><td align=center><em>Eco</em>RⅠ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 
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:<tr><td align=center><em>Pst</em>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 
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:<tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>6 µl</td></tr>
 
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:<tr><td align=center>&nbsp;</td><td align=right>total 60 µl</td></tr>
 
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:</table>
 
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<b>Results</b>
<b>Results</b>
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:泳動後の写真<BR>
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:コロニーは全く生えていなかった。
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:インサートとベクターの量に注意して再度ライゲーションを行う。
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:800bpあたりにバンドが見られ、PCR産物の増幅が確認できた。
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Revision as of 17:14, 3 October 2011



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Home > Notebook > Lab Note > September Language：English/Japanese

９月１日

Member

中川


1.QIAquick Gel Extraction Kitを使用してゲルからpSB1C3のDNAを抽出し、濃度を測定した。
2.8/30に再設計したプライマーを用いて以下の条件でBBa_E0240のPCRを行った。


PCR条件
10 µM GFP Primer F1.5 µl
10 µM GFP Primer R1.5 µl
BBa_E02401 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs4 µl
MgSO44 µl
ddH2O32 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature95°C30sec 
Denature95°C30sec30 Cycle
Anneling50°C1min
Extension68°C1min
End4°Ckeep 




Results

1.泳動後の写真

約2kbのところにバンドが見られた。


抽出したゲルのうち5 µlを20倍希釈し、吸光計で濃度測定をした。


1回目0.019
2回目0.013
3回目0.019
4回目0.022
5回目0.016
ave.0.0178


濃度は17.8ng/µlと算出された。


2.９月２日に続く


９月２日

Member

中川


昨日のBBa_E0240のPCR産物のフェノールクロロホルム処理、PCR産物の増幅を確認するための電気泳動、PCR産物の制限酵素処理を行った。
制限酵素処理は、下記の表に従って反応液を調整し、37°Cでインキュベートした。(overnight)



Results

泳動後の写真


PCR産物の増幅が確認できた。


９月３日

Member

中川



Results


９月５日

Member

中川



Results

コロニーは全く生えていなかった。
インサートとベクターの量に注意して再度ライゲーションを行う。


９月５日

Member

中川


1.ゲルからのDNA抽出
2.pSB1C3のトランスフォーメーション


Results

1.ゲル切り出し後の写真


濃度は510 ng/µlだった。


2.小さいが、コロニーが生えていた。念のために、翌日再度トランスフォーメーションをする。


９月６日

Member

吉村


pSB1C3のトランスフォーメーション


Results

小さいコロニーの生育がみられた。


９月７日

Member

吉村、中川


pSB1C3のプレカルチャー(6サンプル)


Results

6サンプルのうち3サンプルは培養に成功した。
3サンプルはコンタミの可能性があるため、念を入れて翌日もプレカルチャーを行うことにした。


９月８日

Member

中川


1.pSB1C3のプレカルチャー(6サンプル)
2.プライマーの再設計


Results

1.コンタミすることなく培養に成功した。
2.以下のように設計した。
F: 3' TTGAATTCTTTTCTAGATTTCGTAAAGGAGAAGAA

　　　　　 　　 EcoRⅠ　 　　XbaⅠ

Tm値:68.8゜C　　35塩基


８月３１日

Member

中川


pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理をした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。
ddH2O2 µl
BBa_E024050 µl
EcoRⅠ1 µl
PstⅠ1 µl
10 x H Buffer6 µl
 total 60 µl


制限酵素処理後、100 V 30minで電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


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