Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNote/GFPMLF9J

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==''9月2日''==
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9月1日

Member

中川


1.QIAquick Gel Extraction Kitを使用してゲルからpSB1C3のDNAを抽出し、濃度を測定した。
2.8/30に再設計したプライマーを用いて以下の条件でPCRを行った。


PCR条件
10 µM GFP Primer F1.5 µl
10 µM GFP Primer R1.5 µl
BBa_E02401 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs4 µl
MgSO44 µl
ddH2O32 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature95°C30sec 
Denature95°C30sec30 Cycle
Anneling50°C1min
Extension68°C1min
End4°Ckeep 




Results

1.泳動後の写真

約2kbのところにバンドが見られた。


抽出したゲルのうち5 µlを20倍希釈し、吸光計で濃度測定をした。


1回目0.019
2回目0.013
3回目0.019
4回目0.022
5回目0.016
ave.0.0178


濃度は17.8ng/µlと算出された。


2.9月2日に続く


9月2日

Member

中川


昨日のPCR産物のフェノールクロロホルム処理、PCR産物の増幅を確認するための電気泳動、PCR産物の制限酵素処理を行った。
制限酵素処理は、下記の表に従って反応液を調整し、37°Cでインキュベートした。(overnight)



Results

泳動後の写真




9月3日

Member

中川



Results


9月4日

Member

吉村、中川


23日に作製したプライマーを用いて、以下の条件でPCRを行った。
PCR条件
10 µM GFP Primer F1.5 µl
10 µM GFP Primer R1.5 µl
BBa_E02401 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs4 µl
MgSO44 µl
ddH2O32 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature95°C30sec 
Denature95°C30sec30 Cycle
Anneling50°C1min
Extension68°C1min
End4°Ckeep 
PCR産物が増幅していることを確認するため、アガロース電気泳動を行った。
PCR産物の増幅を確認した後、下表に従ってPCR産物の制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
ddH2O2 µl
BBa_E024050 µl
EcoRⅠ1 µl
Pst1 µl
10 x H Buffer6 µl
 total 60 µl


Results

泳動後の写真


800bpあたりにバンドが見られ、PCR産物の増幅が確認できた。


9月5日

Member

中川


1.ゲルからのDNA抽出
2.pSB1C3のトランスフォーメーション


Results

1.ゲル切り出し後の写真


濃度は510 ng/µlだった。


2.小さいが、コロニーが生えていた。念のために、翌日再度トランスフォーメーションをする。


9月6日

Member

吉村


pSB1C3のトランスフォーメーション


Results

小さいコロニーの生育がみられた。


9月7日

Member

吉村、中川


pSB1C3のプレカルチャー(6サンプル)


Results

6サンプルのうち3サンプルは培養に成功した。
3サンプルはコンタミの可能性があるため、念を入れて翌日もプレカルチャーを行うことにした。


9月8日

Member

中川


1.pSB1C3のプレカルチャー(6サンプル)
2.プライマーの再設計


Results

1.コンタミすることなく培養に成功した。
2.以下のように設計した。
F: 3' TTGAATTCTTTTCTAGATTTCGTAAAGGAGAAGAA

         EcoRⅠ    Xba

Tm値:68.8゜C  35塩基


8月31日

Member

中川


pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理をした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。
ddH2O2 µl
BBa_E024050 µl
EcoRⅠ1 µl
Pst1 µl
10 x H Buffer6 µl
 total 60 µl


制限酵素処理後、100 V 30minで電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


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