Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNote/GFPMLF9J

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９月１日

Member

中川

QIAquick Gel Extraction Kitを使用してゲルからpSB1C3のDNAを抽出し、濃度を測定した。

8/30に再設計したプライマーを用いて以下の条件でPCRを行った。

PCR条件 10 µM GFP Primer F 1.5 µl 10 µM GFP Primer R 1.5 µl BBa_E0240 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 95°C 30sec   Denature 95°C 30sec 30 Cycle Anneling 50°C 1min Extension 68°C 1min End 4°C keep

Results

泳動後の写真

約2kbのところにバンドが見られた。

抽出したゲルのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした

濃度測定は吸光度計を用いて測った。

その際、吸光度は5回の平均値を算出したものを用いた。

1回目	0.019
2回目	0.013
3回目	0.019
4回目	0.022
5回目	0.016
ave.	0.0178

濃度は17.8ng/µlと算出された

９月２日

Member

吉村、中川

1.BBa_E0240のプレカルチャー

2.BBa_E0240からATG GFPを作るためのプライマー設計

Results

1.全てのサンプルに大腸菌の増殖がみられた。

2.以下のように設計した。

F: 3' TTGAATTCTTTCTAGATTCGTAAAGGAGAAGAA

　　　　　 　　 EcoRⅠ　　　XbaⅠ

Tm値:67.75°C　　33塩基

R: 5' AAACTGCAGAAAACTAGTTTTTTATTATTTGTATAG

　　　　　 　 　　 PstⅠ　　　SpeⅠ

Tm値:67.66°C　　36塩基

９月３日

Member

吉村、中川

BBa_E0240のアルカリミニプレップをした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。

ddH2O	2 µl
BBa_E0240	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

制限酵素処理後、100 V 30minでアガロース電気泳動行った。

Results

泳動後の写真

800bpあたりにバンドが出ていた。

９月４日

Member

吉村、中川

23日に作製したプライマーを用いて、以下の条件でPCRを行った。

PCR条件 10 µM GFP Primer F 1.5 µl 10 µM GFP Primer R 1.5 µl BBa_E0240 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 95°C 30sec   Denature 95°C 30sec 30 Cycle Anneling 50°C 1min Extension 68°C 1min End 4°C keep

PCR産物が増幅していることを確認するため、アガロース電気泳動を行った。

PCR産物の増幅を確認した後、下表に従ってPCR産物の制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)

ddH2O	2 µl
BBa_E0240	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

Results

泳動後の写真

800bpあたりにバンドが見られ、PCR産物の増幅が確認できた。

９月５日

Member

中川

1.ゲルからのDNA抽出

2.pSB1C3のトランスフォーメーション

Results

1.ゲル切り出し後の写真

濃度は510 ng/µlだった。

2.小さいが、コロニーが生えていた。念のために、翌日再度トランスフォーメーションをする。

９月６日

Member

吉村

pSB1C3のトランスフォーメーション

Results

小さいコロニーの生育がみられた。

９月７日

Member

吉村、中川

pSB1C3のプレカルチャー(6サンプル)

Results

6サンプルのうち3サンプルは培養に成功した。

3サンプルはコンタミの可能性があるため、念を入れて翌日もプレカルチャーを行うことにした。

９月８日

Member

中川

1.pSB1C3のプレカルチャー(6サンプル)

2.プライマーの再設計

Results

1.コンタミすることなく培養に成功した。

2.以下のように設計した。

F: 3' TTGAATTCTTTTCTAGATTTCGTAAAGGAGAAGAA

　　　　　 　　 EcoRⅠ　 　　XbaⅠ

Tm値:68.8゜C　　35塩基

８月３１日

Member

中川

pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理をした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。

ddH2O	2 µl
BBa_E0240	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

制限酵素処理後、100 V 30minで電気泳動を行った。

Results

泳動後の写真

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