Team:KIT-Kyoto/GFP-MLF実験かんたん

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Revision as of 16:58, 2 October 2011

8/22(月)
吉村、中川、松浪

・BBa_E0240のトランスフォーメーション
【結果】
コロニーの生育がみられた。

8/23(火)
吉村、中川

・BBa_E0240のプレカルチャー

【結果】
全てのサンプルに大腸菌の増殖がみられた。

・BBa_E0240からno ATG GFPを作るため以下のようにプライマー設計をした。

F: 3' TTGAATTCTTTCTAGATT CGTAAAGGAGAAGAA
　　　　　EcoRⅠ　　　　XbaⅠ
Tm値:67.75゜C　　33塩基

R: 5' AAACTGCAGAAAACTAGTTTTTTATTATTTGTATAG
　　　　　 PstⅠ　　　　　SpeⅠ
Tm値:67.66゜C　　36塩基

8/24(水)　11:00～
吉村、中川

BBa_E0240のアルカリミニプレップをした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。

ddH₂O	2 µl
BBa_E0240	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

制限酵素処理後、100 V 30minで電気泳動した。
【結果】
泳動後の写真

800bpあたりにバンドが出ていた。

8/25(木)　11:00～
吉村、中川

PCR

以下の条件でPCRを行った。

PCR条件

10 µM GFP Primer F	1.5 µl
10 µM GFP Primer R	1.5 µl
鋳型 DNA	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	4 µl
MgSO₄	4 µl
ddH₂O	32 µl
KOD Plus	1 µl
	全量 50 µl

Cycle条件

Start	95°C、30秒
Cycle x 30	95°C、30秒(熱変性)
	(Tm-5)°C、1分(アニーリング)
	68°C、1kb/分(伸長)
End	4°Cで保持

PCR産物が増幅していることを確認するため、アガロース電気泳動を行った。

泳動後の写真

800bpあたりにバンドが見られ、PCR産物の増幅が確認できた。

PCR産物の増幅を確認した後、下表に従ってPCR産物の制限酵素処理を行った。

ddH₂O	2 µl
BBa_E0240	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

37゜Cでインキュベートした(overnight)。

8/26(金)
中川　17:00～

・ゲルからのDNA抽出

ゲル切り出し後の写真

濃度は510 ng/µlだった。

・pSB1C3のトランスフォーメーション

【結果】
小さいが、コロニーが生えていた。
念のために、翌日再度トランスフォーメーションをする。

8/27(土)
吉村

pSB1C3のトランスフォーメーション

【結果】
小さいコロニーの生育がみられた。

★謎！！！★
8/29(月)
pSB1C3のプレカルチャー
【実験方法】
8/26に培養した提出用ベクターのコロニーの生えたプレートを用いた
↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養した
↓プレートからシングルコロニーを分離した
↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養した

【結果】
翌日コンタミしてると考えられるビン3本培養に成功したビンが3本できた
ただ念を入れて翌日同じ操作を行うことにした。

★実験内容が謎…泳動の写真があるのになぜ電気泳動の記述がない？しかも過去形にしてない★
8/30(火)
(目的)
大会提出用ベクターpsb1c3の培養→トラフォ(二回目) (方法)
8/26に培養した提出用ベクターのコロニーの生えたプレートを昨日同様用いた
↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養する

(結果)
翌日6本培養したがコンタミすることなく無事に大腸菌を回収することができた

8/31(水)
中川

pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理、電気泳動、制限酵素処理

@@ Line 146: / Line 146: @@
 中川　17:00～<br>
 <BR>
-ゲルからのDNA抽出<br>
+・ゲルからのDNA抽出<br>
 <br>
-【結果】<br>
-</span></span>濃度は510
-ng/&micro;lだった。<br>
-<BR>
 ゲル切り出し後の写真<BR>
 <IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/c/ce/8.26GFP%E3%82%B2%E3%83%AB%E6%8A%BD.jpg" width="250px" height="250px" border="0"><BR>
+<br>
+濃度は510 ng/µlだった。<br>
 <BR>
 <BR>
-pSB1C3のトランスフォーメーション<br>
+<BR>
+・pSB1C3のトランスフォーメーション<br>
 <br>
 【結果】<br>
@@ Line 223: / Line 219: @@
 <BR>
 <BR>
-★実験内容が謎…ミニプレの記述しかないし、何のDNAかもわからない★<BR>
 /31(水)<BR>
-(目的)<BR>
+中川<BR>
-培養した菌液のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理、電気泳動、制限酵素処理<BR>
+<BR>
-アルカリミニプレを最初に行った。<BR>
+pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理、電気泳動、制限酵素処理<BR>
-<tr><td><table border=1 width="280px">
+<BR>
-<tr><td width="80px" align=center>Solution I</td><td width="200px"  align=right>50 mM グルコース (MW 180)</td></tr>
-<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>10 mM EDTA(pH 8.0)</td></tr>
-<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>25 mM Tris-HCl (pH 8.0)</td></tr>
-<tr><td align=center>Solution II</td><td align=right>0.2 N NaOH</td></tr>
-<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>1% SDS</td></tr>
-<tr><td align=center>Solution III</td><td align=right>3 M 酢酸カリウム</td></tr>
-<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>1.8 M 酢酸</td></tr>
-</table>
-↓LBプレート(amp+)に大腸菌をまき、37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩培養する<BR>
-↓プレートからシングルコロニーを分離する<BR>
-↓2 mlのLB培地で37°C(API2-MALT1は30°C)で一晩振とう培養する<BR>
-↓1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4°Cで5分間遠心し、上清を捨てる<BR>
-↓100 µlの氷冷したSolution Iを加え、ボルテックスする<BR>
-↓沈殿物を溶かした後、200 µlのSolution IIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない<BR>
-↓氷上で5分間冷やす<BR>
-↓150 µlのSolution IIIを加え、混ぜる、ボルテックスは使用しない<BR>
-↓氷上で5分間冷やす<BR>
-↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心する<BR>
-↓上清を新しいチューブにとり、沈殿物は廃棄する<BR>
-↓450 µlのイソプロパノールを加え、混ぜる<BR>
-↓2分間室温で放置する<BR>
-↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる<BR>
-↓150～200 µlの70%エタノールを加え、軽くボルテックスする<BR>
-↓2分間室温で放置する<BR>
-↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てる<BR>
-↓沈殿を10分～15分乾かす<BR>
-↓RNaseのはいったTEを20 µl加えて37°Cで培養する<BR>
 <BR>