Team:Lyon-INSA-ENS/Realisation/Protocols/BiofilmQuantFr

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Ce protocole permet de couper les plasmides au niveau de sites de restriction spécifiques, en utilisant des enzymes de restriction.
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Ce protocole a pour but de quantifier l'adhérence d'une souche en plaque 24 puits.<br/> <br/>
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Toutes les solutions doivent être stériles. Les solutions d'EDTA et le CoCl2 ont été stérilisées par filtration sur un filtre 0.2µm.  
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<b>1.</b> Dans un tube Eppendorf, ajouter, dans un ordre quelconque, les solutions suivantes: <br/>
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<b>1.</b> Préparer 10mL du milieu voulu dans des falcon de 15mL. Chacun sera utilisé pour remplir une colonne de 4 puits.
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-250 ng d'ADN ( si la concentration est inconnue, utiliser 5µL )<br/>
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-2.5µL (1X) ou 5µL (2X) de tampon "tango" 10X ( la quantité introduite dépend des enzymes utilisées)<br/>
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-de l'eau pour atteindre un volume total de 25µL après addition des enzymes
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<b>2.</b> Faire pousser des cultures 5mL des souches voulues avec l'antibiotique approprié si la souche a une résistance (50µL) pendant la nuit, dans le même milieu que celui qui va être utilisé pour le test.
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<b>3.</b> Incuber à 37°C pendant 1h30.
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<b>3.</b> Ajouter toute autre solution requise dans les falcon ( 100 µL antibiotique, CoCl2 pour obtenir la concentration voulue...)
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<b>4.</b> Incuber à 70°C pendant 10min afin d'inactiver les enzymes de restriction.
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<b>4.</b> Mesurer la DO600 des cultures de 5mL et ajouter un volume approprité de bactéries aux 10mL de milieu pour obtenir une concentration de 10⁷ bactérires/mL ( une DO de 0.6 est équivalente à 2.10⁸ bacteries/mL )
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<b>5.</b> Rincer la plaque 24 puits avec de l'EDTA stérile 4mM colonne par colonne, vider la plaque, laver à l'eau stérile, vider la plaque. Cette étape permet la capture des métaux présents sur la plaque et qui pourraient gêner le test.
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<b>8. Méthode DO600</b> Transférer les 2mL de surnageant dans un tube à hémolyse (S)<br/>
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Rincer le biofilm avec 1mL de milieu ( le même que celui utilisé pour la culture ) et l'ajouter aux tubes S <br/>
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Ajouter 1mL de milieu et gratter le biofilm. Verser dans un autre tube à hémolyse (Bà et vortexer pendant 20s.<br/>
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Mesurer la DO600 de chaque tube. Le % d'adhérence est 100*B/(B+3S)<br/>
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<b>8. Méthode au cristal violet</b>Eliminer le surnageant<br/>
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Rincer le biofilm avec 1mL de milieu et éliminer le liquide de rinçage<br/>
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Chauffer la plaque à 80°C pendant 1h. Ajouter 0.2mLd'une solution de cristal violet et attendre 2mn.Le cristal violet est toxique et doit être manipulé sous une hotte avec des gants.<br/>
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2liminer le colorant et rincer à l'eau. Sécher la plaque.<br/>
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Latest revision as of 10:31, 13 September 2011





Quantification de biofilms





Ce protocole a pour but de quantifier l'adhérence d'une souche en plaque 24 puits.

Toutes les solutions doivent être stériles. Les solutions d'EDTA et le CoCl2 ont été stérilisées par filtration sur un filtre 0.2µm.





Procédure



1. Préparer 10mL du milieu voulu dans des falcon de 15mL. Chacun sera utilisé pour remplir une colonne de 4 puits.



2. Faire pousser des cultures 5mL des souches voulues avec l'antibiotique approprié si la souche a une résistance (50µL) pendant la nuit, dans le même milieu que celui qui va être utilisé pour le test.



3. Ajouter toute autre solution requise dans les falcon ( 100 µL antibiotique, CoCl2 pour obtenir la concentration voulue...)



4. Mesurer la DO600 des cultures de 5mL et ajouter un volume approprité de bactéries aux 10mL de milieu pour obtenir une concentration de 10⁷ bactérires/mL ( une DO de 0.6 est équivalente à 2.10⁸ bacteries/mL )



5. Rincer la plaque 24 puits avec de l'EDTA stérile 4mM colonne par colonne, vider la plaque, laver à l'eau stérile, vider la plaque. Cette étape permet la capture des métaux présents sur la plaque et qui pourraient gêner le test.



6. Remplir les puits avec 2mL des tubes de 15mL.



7. Incuber à 30°C pendant 24 à 48h, selon le milieu ( 48h pour M63G, 24h pour LB )



8. Méthode DO600 Transférer les 2mL de surnageant dans un tube à hémolyse (S)
Rincer le biofilm avec 1mL de milieu ( le même que celui utilisé pour la culture ) et l'ajouter aux tubes S
Ajouter 1mL de milieu et gratter le biofilm. Verser dans un autre tube à hémolyse (Bà et vortexer pendant 20s.
Mesurer la DO600 de chaque tube. Le % d'adhérence est 100*B/(B+3S)



8. Méthode au cristal violetEliminer le surnageant
Rincer le biofilm avec 1mL de milieu et éliminer le liquide de rinçage
Chauffer la plaque à 80°C pendant 1h. Ajouter 0.2mLd'une solution de cristal violet et attendre 2mn.Le cristal violet est toxique et doit être manipulé sous une hotte avec des gants.
2liminer le colorant et rincer à l'eau. Sécher la plaque.









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