Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNote/GFPMLF8J

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８月２２日

Member

吉村、中川、松浪


Purpose

BBa_E0240のトランスフォーメーション


Results

コロニーの生育がみられた。


８月２３日

Member

吉村、中川


Purpose

1.BBa_E0240のプレカルチャー
2.BBa_E0240からATG GFPを作るためのプライマー設計


Results

1.全てのサンプルに大腸菌の増殖がみられた。
2.以下のように設計した。
F: 3' TTGAATTCTTTCTAGATTCGTAAAGGAGAAGAA

　　　　　EcoRⅠ　　　　XbaⅠ

Tm値:67.75°C　　33塩基


R: 5' AAACTGCAGAAAACTAGTTTTTTATTATTTGTATAG

　　　　　 PstⅠ　　　　　SpeⅠ

Tm値:67.66°C　　36塩基

８月２４日

Member

吉村、中川


Purpose

BBa_E0240のアルカリミニプレップ
BBa_E0240のアガロース電気泳動


Method

BBa_E0240のアルカリミニプレップをした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。
ddH2O2 µl
BBa_E024050 µl
EcoRⅠ1 µl
PstⅠ1 µl
10 x H Buffer6 µl
 total 60 µl


制限酵素処理後、100 V 30minでアガロース電気泳動行った。


Results

泳動後の写真


800bpあたりにバンドが出ていた。


８月２５日

Member

吉村、中川


Purpose

PCR(23日に作製したプライマーを用いた)
アガロース電気泳動(PCR産物の増幅確認)


Method

以下の条件でPCRを行った。
PCR条件
10 µM GFP Primer F1.5 µl
10 µM GFP Primer R1.5 µl
BBa_E02401 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs4 µl
MgSO44 µl
ddH2O32 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature95°C30sec 
Denature95°C30sec30 Cycle
Anneling50°C1min
Extension68°C1kb/min
End4°Ckeep 
PCR産物が増幅していることを確認するため、アガロース電気泳動を行った。
PCR産物の増幅を確認した後、下表に従ってPCR産物の制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
ddH2O2 µl
BBa_E024050 µl
EcoRⅠ1 µl
PstⅠ1 µl
10 x H Buffer6 µl
 total 60 µl


Results

泳動後の写真


800bpあたりにバンドが見られ、PCR産物の増幅が確認できた。


８月２６日

Member

中川


Purpose

1.ゲルからのDNA抽出
2.pSB1C3のトランスフォーメーション


Results

1.ゲル切り出し後の写真


濃度は510 ng/µlだった。


2.小さいが、コロニーが生えていた。念のために、翌日再度トランスフォーメーションをする。


８月２７日

Member

吉村


Purpose

pSB1C3のトランスフォーメーション


Results

小さいコロニーの生育がみられた。


８月２９日

Member

吉村、中川


Purpose

pSB1C3のプレカルチャー(6サンプル)


Results

6サンプルのうち3サンプルは培養に成功した。
3サンプルはコンタミの可能性があるため、念を入れて翌日もプレカルチャーを行うことにした。


８月３０日

Member

中川


Purpose

1.pSB1C3のプレカルチャー(6サンプル)
プライマーの再設計


Results

1.コンタミすることなく培養に成功した。
2.以下のように設計した。
F: 3' TTGAATTCTTTTCTAGATTTCGTAAAGGAGAAGAA

　　　　　EcoRⅠ　 　　　XbaⅠ

Tm値:68.8゜C　　35塩基



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