Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNote/GFPMLF9

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Revision as of 01:00, 6 October 2011

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1st, September

Member

Nakagawa

1.Using [http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx|QIAquick Gel Extraction Kit] and extracted DNA of pSB1C3 from the gel.

2.DNA bands in the agarose gel.

After extracting DNA,I measured 5µl ,and diluted it for 20 times.

And I measured its density.

3.PCR reaction was carried out by using primers designed on August 30th. The reaction conditions are summarized below.

PCR reaction

<t>

</tr>

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
BBa_E0240	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	4 µl
MgSO₄	4 µl
ddH₂O	32 µl
KOD Plus	1 µl
	total 50 µl

Cycle

Pre-Denature	95°C	30sec
Denature	95°C	30sec	30 Cycle
Anneling	48.5°C	1min
Extension	68°C	1kb/min
End	4°C	keep

Results

2.Image of the agarose gel.

You can see DNA band at around 2kbp.

density

1	0.019
2	0.013
3	0.019
4	0.022
5	0.016
ave.	0.0178

2nd, September

Member

Nakagawa

Isolate BBa_E0240 by phenol-chloroform treatment,Agarose gel electrophoresis and carried out to detect the PCR products.

I digested PCR products with the following restriction enzymes (at 37°C for 16 hours).

ddH₂O	2 µl
BBa_E0240	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

Results

2.Image of the agarose gel.

I can see BBa_E0240 band at the correct place.And the density was enough to watch it.

3rd,September

Member

Nakagawa

Using [http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx|QIAquick Gel Extraction Kit] and extracted DNA of pSB1C3 from the gel.

Results

5th,September

Member

Nakagawa

Ligate BBa_E0240.which doesn’t have ATG codons and pSB1C3

I have transformed E. coli DH5 alpha with it.

Before I made BBa_E0240.which doesn’t have ATG codons and pSB1C3.

The densities are 19ng/µl and 25ng/µl.

DNA samples were digested by the following restriction enzymes at 37 ℃ for 30 min.

BBa_E0240	0.5 µl
pSB1C3	0.5 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total 5 µl

After ligate them, I have transformed E. coli DH5 alpha with it.

Results

There aren’t any colonies on the plate.

However I heared the success probability is very low, so next time I want to be careful about the density.

6th September

Member

Yoshimura,Nakagawa

1.Ligate BBa_E0240.which doesn’t have ATG codons and pSB1C3

DNA samples were digested by the following restriction enzymes at 37 ℃ for 30 min

insert	0.5 µl
vector	0.5 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total 5 µl

However, I ligated them with this density ratio (bector: insert=1:9)

After ligate them, I have transformed E. coli DH5 alpha with it.

2. We attached restriction enzyme site of EcoRⅠand XbaⅠto the Flag-tag dMLF from pUAST Flag-tag dMLF.

We isolated Flag-tag dMLF from pUAST Flag-tag dMLF.

Results

1.There are 4 colonies on the LB plate.

2.F：AAAGAATTCAAATCTAGAAAAATGGACTACAAGGACGA

　　　　　 EcoRⅠ　　XbaⅠ

Tm value:72.14℃ 38bases

R：AAACTGCAGAAAACTAGTAAATACCCTACTTCTTCTTGCC

　　　　 PstⅠ　　　SpeⅠ

Tm value:72.16℃　40bases

7th September

Member

Nakagawa

I did pre-culture of yesterday colonies and pSB1C3.

PCR and restriction enzyme with MLF

PCR条件

10 µM GFP Primer F	1.5 µl
10 µM GFP Primer R	1.5 µl
BBa_E0240	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	4 µl
MgSO₄	4 µl
ddH₂O	32 µl
KOD Plus	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

Pre-Denature	95°C	30sec
Denature	95°C	30sec	30 Cycle
Anneling	50°C	1min
Extension	68°C	1min
End	4°C	keep

After that, I isolated MLF with restriction enzyme.

DNA samples were digested by the following restriction enzymes at 37 ℃ for 16 hours.

ddH₂O	2 µl
Flag tag dMLF	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

Results

8th September

Member

Nakagawa

Using [http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx|QIAquick Gel Extraction Kit] and extracted DNA of Flag tag dMLF from the gel.

Isolatioe pSB1C3 by the alkaline-lysis method by phenol-chloroform treatment, DNA was digested with the following restriction enzymes (30 min at 37℃).

I digested the DNA of pSB1C3 with the following restriction enzymes (at 37°C for 16 hours).

ddH₂O	2 µl
pSB1C3	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

Results

We cannot see any bands of MLF from the gel

So, we are effort to ligate with pSB1C3 and BBa_E0240

9/8(木)
中川
(目的)
・Flag tag dMLFのゲル抽出・pSB1C3のアルカリミニプレップフェノクロ処理、制限酵素処理
(方法)
MLFのゲル抽出
<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用した

提出用ベクターのアルカリミニプレップ、フェノクロ処理をしたのち乾燥させたDNAに50μlのTEに溶かした
そののち制限酵素処理をした

制限酵素処理(提出用ベクター)

下記の組成に従って反応液を調整した

提出用ベクターpSB1C3in ddH₂O	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 58 µl

37°Cで20時間静置した

(結果)
MLFを切り出すときにほとんどバンドは見えなかった。
そこでまずはベクターとGFPのライゲーションに明日から力を入れることにした。

9/9★おｋ★
(目的)
ベクターとGFPのライゲーションのためのエタノール沈殿
(方法)
まずアドバイザーの方にどうしてライゲーションが失敗するのかを聞いてみた。すると以下の原因が考えられるとなった。
インサート、ベクターの濃度自体が薄すぎるのではないかという問題
そもそも抗生物質自体がうまく働いていないのではないか
制限酵素処理が完全にし切れていないのではないか

そこでエタノール沈殿をすることでベクターとGFPの濃度をあげることによりライゲーションの効率を上げることを画策した

(結果) エタノール沈殿に失敗し沈殿すべきDNAが見当たらず濃度を濃く出来なくなった。
よって再度プレカルチャーの方をあす以降進めていくことになった

9/12(月)

吉村、中川

PCR
【目的】
9/6に作製したプライマーを用いてをFlag-tag dMLFを増幅させる

【実験方法】
以下の2条件で各1サンプルずつPCRを行った。

PCR条件(1)

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	4 µl
MgSO₄	4 µl
ddH₂O	32 µl
KOD Plus	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

</td><td width="100px"> </td>

<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr> <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>55°C</td><td align=center>30sec</td></tr> <tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1min 20sec</td></tr> <tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px"> </td></tr> </table> </td></tr> </table>

Pre-Denature

94°C

2min

PCR条件(2)

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	4 µl
MgSO₄	2 µl
ddH₂O	34 µl
KOD Plus	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

</td><td width="100px"> </td>

<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr> <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>55°C</td><td align=center>30sec</td></tr> <tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1min 20sec</td></tr> <tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px"> </td></tr> </table> </td></tr> </table>
各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。

【結果】
アガロースゲル電気泳動に続く

(目的)
大腸菌のプレカルチャー、GFPのPCR,フェノクロ処理、制限酵素処理
(方法)
昨日全ての素材を失ってしまったのでもう一度両方の素材を作り直すことにした

大腸菌をまずは殖菌することにした
↓LBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)に大腸菌をまき、37°Cで一晩培養する
↓プレートからシングルコロニーを分離する
↓2 mlのLB培地で37°Cで一晩振とう培養する

GFPの方ももう一度PCRからやり直すことにした

PCR

Pre-Denature

94°C

2min

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
GFP	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	4 µl
MgSO₄	4 µl
ddH₂O	32 µl
KOD Plus	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

</td><td width="100px"> </td>

<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>95°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>30 Cycle</td></tr> <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>48.5°C</td><td align=center>1min</td></tr> <tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr> <tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px"> </td></tr> </table> </td></tr> </table>
上記の組成に従って混ぜた

制限酵素処理(GFP)

下記の組成に従って反応液を調整した

BBa_E0240のアルカリミニプレップをした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。

Pre-Denature

95°C

30sec

ddH₂O	2 µl
BBa_E0240	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

(結果)
大腸菌の方は翌日順調に増えていた、しかし大腸菌の色が明らかに違うものも混じっていた
もしかしたらプレート自体に劣化が始まっているのかもしれない
PCRにいたっては順調に増えていた

9/13(火)

吉村

アガロースゲル電気泳動
【目的】
PCRで目的のDNAが増幅しているかを調べる。

【実験方法】

【結果】
泳動後の写真
<IMG src=" 2011.9.13%E5%AE%9F%E9%A8%93MLF-PCR%E3%83%81%E3%82%A7%E3%83%83%E3%82%AF.JPG " width="240px" height="280px" border="0">

PCR条件(1)の方が少しバンドが濃くなっていた。
マーカーが流れてしまった。
次回からPCR条件(1)の条件でPCRを行う。
マーカーが流れてしまったので、次回からは泳動時間を短くして電気泳動を行う。

Flag-tag dMLFの制限酵素処理
【目的】
Flag-tag dMLFのシーケンスを調べたところ、PstⅠとXbaⅠの制限酵素サイトがみられたので、Flag-tag dMLFのPCR産物が途中でPstⅠとXbaⅠによって切れてしまわないかを調べる

【実験方法】
下表に従って、3サンプル制限酵素処理を行った。
(1)

MilliQ	6.5 µl
Flag-tag dMLF	20 µl
PstⅠ	0.5 µl
10 x H Buffer	3 µl
	total 30 µl

(2)

MilliQ	6.5 µl
Flag-tag dMLF	20 µl
XbaⅠ	0.5 µl
10 x M Buffer	3 µl
	total 30 µl

(3)

MilliQ	6 µl
Flag-tag dMLF	20 µl
PstⅠ	0.5 µl
XbaⅠ	0.5 µl
10 x M Buffer	3 µl
	total 30 µl

37゜Cで50分間インキュベートした後、アガロースゲル電気泳動を行った。

【結果】
泳動後の写真
<IMG src=" 2011.09.13MLF%E3%83%81%E3%82%A7%E3%83%83%E3%82%AFPst.Xba.JPG " width="240px" height="280px" border="0">

<IMG src=" 2011.09.13MLF%E3%83%81%E3%82%A7%E3%83%83%E3%82%AFXba.JPG " width="240px" height="280px" border="0">
Flag-tag dMLFはPstⅠとXbaⅠの制限酵素処理によって切れることはなかった。
マーカーが開ききっていなかった。

【考察】
今回の実験ではFlag-tag dMLFはPstⅠとXbaⅠの制限酵素処理によって切れることはなかったが、制限酵素処理時間が短いという可能性があるため、制限酵素処理時間を長くして再度実験を行う。
また、マーカーのラダーが開ききっていないため、泳動時間が短かったと考えられる。
次回はゲルの濃度を2倍にして電気泳動を行う。

PCR
【目的】
9/6に作製したプライマーを用いてFlag-tag dMLFを増幅させる

【実験方法】
以下の条件で4サンプルPCRを行った。

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
Template DNA	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	4 µl
MgSO₄	4 µl
ddH₂O	32 µl
KOD Plus	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

</td><td width="100px"> </td>

<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>15sec</td><td align=center rowspan=3>35 Cycle</td></tr> <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>55°C</td><td align=center>30sec</td></tr> <tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1min 20sec</td></tr> <tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px"> </td></tr> </table> </td></tr> </table>

各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。

【結果】
アガロースゲル電気泳動に続く

9/13
(目的)
再度GFPのPCR、ベクターのアルカリミニプレップ、フェノクロ処理、制限酵素処理
(方法)
昨日行ったGFPのPCRを行った量ではこの後の失敗が起こった時に心もとないということで保管する名目で再度PCRを行った

PCR

Pre-Denature

94°C

2min

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
GFP	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	4 µl
MgSO₄	4 µl
ddH₂O	32 µl
KOD Plus	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

</td><td width="100px"> </td>

<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>95°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>30 Cycle</td></tr> <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>48.5°C</td><td align=center>1min</td></tr> <tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr> <tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px"> </td></tr> </table> </td></tr> </table>
上記の組成に従って混ぜた

制限酵素処理(GFP)

下記の組成に従って反応液を調整した

BBa_E0240のアルカリミニプレップをした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。

Pre-Denature

95°C

30sec

ddH₂O	2 µl
BBa_E0240	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

次に同時進行でベクターの方は菌が増えていたのでアルカリミニプレップ、フェノクロ処理、制限酵素処理を行った

フェノクロ処理後は

制限酵素処理(ベクター)

pSB1C3のアルカリミニプレップをした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。

ddH₂O	2 µl
pSB1C3	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

(結果)
GFPの方は昨日同様に成功しているといえた、そしてベクターの方も順調に増えていたので無事にDNAを回収できた

9/14(水)

吉村

アガロースゲル電気泳動
【目的】
PCRで目的のDNAが増幅しているかを調べる。

【結果】
泳動後の写真
<IMG src=" 2011.09.14MLF-PCR%E3%83%81%E3%82%A7%E3%83%83%E3%82%AF.JPG " width="240px" height="280px" border="0">
ゲルの濃度を2倍にしたところ、マーカーが流れることがなかった。
Flag-tag MLFの電気泳動に関しては今後、2%のアガロースゲルで行うこととする。

9/14
(目的)
GFP、提出用ベクターのゲル抽出
(方法)

<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用してゲルからGFP、ベクターのDNAを抽出した。

その後吸光度計を使って濃度の測定をした。

GFPの濃度測定

1回目	0.158
2回目	0.147
3回目	0.160
4回目	0.159
5回目	0.158
ave.	0.156

提出用ベクターの濃度測定

1回目	0.029
2回目	0.021
3回目	0.028
4回目	0.022
5回目	0.025
ave.	0.025

左、GFPのゲル抽出写真　右、ベクターのゲル抽出写真
<IMG src=" 2011.09.14_%E4%B8%AD%E5%B7%9D.JPG " width="240px" height="280px" border="0">

(結果)
ゲルからの抽出はGFPは成功して吸光度計での測定で156ng/µlを記録した、そしてベクターの方は薄いながらも25ng/μlとなり材料がそろった
そこで翌日から再度ライゲーションの実験に入ることにした

9/15
(目的)
GFP、ベクターのライゲーションとベクターのプレカルチャー
(方法)
それぞれの濃度は156ng/µlと25 ng/µlだった。

そこで先の失敗より濃度の割合を変えて下記の組成に従って反応液を調整した
提出用ベクター:GFP＝1:2

insert	0.3 µl
vector	2.0µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.7 µl
	total 7 µl

提出用ベクター:GFP＝1:5

insert	1.0 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	2.0 µl
	total 7 µl

提出用ベクター:GFP＝1:10

insert	1.3 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.7 µl
	total 7 µl

16°C、30minでincubateした
ライゲーション後、形質転換を行うためにトラフォを行った。

(結果)
ライゲーションに関しては翌日のコロニーの育成は見られなかった
プレカルチャーした大腸菌は数本赤色残り白色といった色の違いが出来ていたが無事に増えて濁っていた

9/16
(目的)
GFPとベクターのライゲーション、育成した大腸菌のアルカリミニプレップ、プレカルチャー
(方法)
それぞれの濃度は156ng/µlと25 ng/µlだった。

そして先の失敗より濃度の割合を変えるだけでなく回復培養を行った。下記の組成に従って反応液を調整した
提出用ベクター:GFP＝1:2

insert	0.3 µl
vector	2.0µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.7 µl
	total 7 µl

提出用ベクター:GFP＝1:5

insert	1.0 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	2.0 µl
	total 7 µl

提出用ベクター:GFP＝1:10

insert	1.3 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.7 µl
	total 7 µl

16°C、30minでincubateした
ライゲーション後、、形質転換を行い、その後にSOC培地300μlに注入し30分培養後プレートにまいた

(結果)
GFPのコロニーの育成はほとんど見られなかった
大腸菌は途中でDNAが消えてしまい精製することが不可能になった

9/17(土)

吉村・横井川

ライゲーション

9/17
(目的)
GFPとベクターのライゲーション、アルカリミニプレップ、プレカルチャー
(方法)
下記の組成に従って反応液を調整した
提出用ベクター:GFP＝1:2

insert	0.3 µl
vector	2.0µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.7 µl
	total 7 µl

提出用ベクター:GFP＝1:5

insert	1.0 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	2.0 µl
	total 7 µl

提出用ベクター:GFP＝1:10

insert	1.3 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.7 µl
	total 7 µl

16°C、30minでincubateした
ライゲーション後、、形質転換を行い、その後にSOC培地300μlに注入し30分培養後プレートにまいた<BR

大腸菌のベクターのアルカリミニプレップとプレカルチャーを行った
このときの留意点として赤いコロニーのみつつくことを心がけてコンタミの可能性を下げることを考えた

(結果)
今度はライゲーション産物におかしな量のコロニーの育成が見られた、もしかしたらコンタミの可能性があると考えられる（抗生物質が効いていない）、ベクターはまた精製することが出来なかった。
9/18
(目的)
プレートチェックをすることにした、ベクターの精製をまたすることにした
(方法)
pSB1C3のアルカリミニプレップをした
プレートチェックのためにコンピテントセルのみを今まで使っていた培地にまいて増えるかどうかを見てみることにした

(結果)
プレート自体がおかしくなっているのではないかという推測は間違ってはおらず
プレートに生えるはずのないコロニーが出てきているのもあった。
また新しくプレートを明日から作り直すことにした

9/19(月)
トランスフォーメーション

【目的】

【実験方法】 ↓氷上でコンピテント細胞(XL1-Blue:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やす
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓0.9 mlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振とう培養した
↓1 mlをLBプレート(+amp,+kan,+camのいずれか)にまいた
↓37°Cで一晩培養した

【結果】

制限酵素処理
【目的】
Flag-tag dMLFのシーケンスを調べたところ、PstⅠとXbaⅠの制限酵素サイトがみられたので、Flag-tag dMLFのPCR産物が途中でPstⅠとXbaⅠによって切れてしまわないかを調べる。

【実験方法】
下表に従って、3サンプル制限酵素処理を行った。
(1)

MilliQ	6.5 µl
Flag-tag dMLF	20 µl
PstⅠ	0.5 µl
10 x H Buffer	3 µl
	total 30 µl

(2)

MilliQ	6.5 µl
Flag-tag dMLF	20 µl
XbaⅠ	0.5 µl
10 x M Buffer	3 µl
	total 30 µl

(3)

MilliQ	6 µl
Flag-tag dMLF	20 µl
PstⅠ	0.5 µl
XbaⅠ	0.5 µl
10 x M Buffer	3 µl
	total 30 µl

37゜Cで18時間インキュベートした後、アガロースゲル電気泳動を行った。

ゲル1枚当たりの組成

SeaKem^RGTG^R-agar	0.4 g
1 x TAE	20 ml

↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 µlに対して6 x loading dye を10 µl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、100 V 20minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した

【結果】
泳動後の写真
<IMG src=" 2011.09.19MLF%E3%83%81%E3%82%A7%E3%83%83%E3%82%AF.JPG " width="240px" height="280px" border="0">
Flag-tag dMLFはPstⅠとXbaⅠの制限酵素処理によって切れることはなかった。

9/19
(目的)
ベクター、GFPの濃度をもう一度計ってみるために濃度チェックをした
ライゲーションの失敗がコンタミしたプレートによるものであると考えて、新しいプレートでもう一度GFPとベクターを精製しなおすことにした
一応おかしな量ではあるがプレカルチャーをしてみることにした
(方法)
GFPの濃度チェックをするために以下の希釈を行った

1倍希釈	1µl
2倍希釈	1µl
4倍希釈	1µl
8倍希釈	1µl

GFPの濃度チェックのための電気泳動写真
<IMG src=" 2011.09.19_GFP%E6%BF%83%E5%BA%A6%E3%83%81%E3%82%A7%E3%83%83%E3%82%AF.JPG " width="250px" height="250px" border="0">

(結果)
GFPの増え方は良好で大きなコロニーの育成が見られた
大腸菌ベクターの方もGFP程ではなかったがある程度の数が生えていたのでよかった
一応白く濁りはしていたので大腸菌の増えていることは確認することが出来た

9/20(火)

アルカリミニプレップ
【目的】
形質転換した大腸菌からプラスミドDNAを回収、精製する。

【実験方法】

Solution I	50 mM グルコース (MW 180)
	10 mM EDTA(pH 8.0)
	25 mM Tris-HCl (pH 8.0)
Solution II	0.2 N NaOH
	1% SDS
Solution III	3 M 酢酸カリウム
	1.8 M 酢酸

↓前日にプレカルチャーした1.5 mlの培養液を1.5 mlチューブにうつした
↓15,000 rpm、4°Cで1分間遠心し、上清を捨てた
↓100 µlの氷冷したSolution Iを沈殿に加え、懸濁した
↓200 µlのSolution IIを加え、混ぜた
↓氷上で5分間冷やした
↓150 µlの氷冷したSolution IIIを加え、穏やかに反転し混ぜた
↓氷上で5分間冷やした
↓15,000 rpm、4°Cで5分間遠心した
↓400 µlのきれいな上清を注意してピペットで新しいチューブにとった
↓900 µlのイソプロパノールを加え、混ぜた
↓2分間室温で放置した
↓15,000 rpm、4°Cで10分間遠心し、上清を捨てた
↓1 mlの70%エタノールを加えた
↓ 15,000 rpm、4°Cで2分間遠心し、上清を捨てた
↓沈殿を10分～15分乾かした
↓プラスミドDNAを30 µlのRNaseのはいったTEに溶かした

【結果】

トランスフォーメーション
【目的】
pSB1C3のバックグラウンドチェック

【実験方法】

↓氷上でコンピテント細胞(XL1-Blue:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに100 µlのコンピテント細胞を分注した
↓DNAをチューブに1～5 µl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓素早く氷上に移し、2分間冷やした
↓300 µlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓1 mlをLBプレート(+クロラムフェニコール)にまいた
↓37°Cで一晩培養した

【結果】

ライゲーション
【目的】

【実験方法】

【結果】
どのプレートにも無数のコロニーが生えていた。

9/20
(目的)
昨日殖やしたおかしなライゲーション産物コロニーのアルカリミニプレップ、MLFの濃度をチェック、ベクターのプレカルチャー
(方法)
ベクターの方は濃度も薄いということでこれからもどんどん殖やしていこうということにした
そこで2mlの培地を8本分殖やしたものをアルカリミニプレップしていった

MLFの濃度も昨日同様にニサンプルあるので希釈を四倍までで行っていった
そしてその後の二回目は8倍から32倍の希釈を行ってみた

MLF	5μl
loading dye	1μl

左　一回目のMLFの電気泳動　右　二回目のMLFの電気泳動
<IMG src=" 2011.09.20_MLF%E6%BF%83%E5%BA%A6%E3%83%81%E3%82%A7%E3%83%83%E3%82%AF.JPG " width="240px" height="280px" border="0">

(結果)
途中でベクターが消えてしまった
MLFのほうは濃度チェックをしてみたところおよそ一回目では濃すぎて分からないので二回目薄くして70ng/µlくらいではないかということが分かりました
9/21
(目的)
プレート作成（濃度を分けて）、昨日の大腸菌のアルカリミニプレップ、プレートチェック
(方法)
プレート自体の劣化も大きく可能性としてあり得るのでここでクローラムフェにコールを新しいものにしの濃度を変化させてプレートを作成した

プレート作成の濃度
そのⅠ

LB培地	300ml
Chloramphenicol	300μl

そのⅡ

LB培地	300ml
Chloramphenicol	600μl

そのⅢ

LB培地	300ml
Chloramphenicol	1.2ml

上記のプレートを作成し、それぞれ12枚程度できた。

もしものために行ったおかしな量であったコロニーを突っついて増えたベクターを精製して電気泳動した。
条件は100v,30分で行った。

(結果)
昨日の大腸菌が多少DNAの沈殿があったので電気泳動したがバンドはできなかった。

9/22(木)

ライゲーション
【目的】

【実験方法】

【結果】

9/22
(目的)
ベクターのアルカリミニプレップ、プレカルチャー、プレートチェック
(方法)
こうなってくると後はくっつくまで試していくしかないのでそのためのベクターの精製とライゲーションを行った

最初はベクターのアルカリミニプレップを行った。

そして昨日作ったものに今まで使っていたコンピテントセル（XL1-Blue)のみをまいて増えないことを確認してみた
その後に今までで成功していたpSB1C3のコロニーでプレカルチャーをした。

(結果)
プレートチェックは予想通り生えることはなく成功だった、そして形質転換も少なかったがコロニーを確認できた

9/23(金)

トランスフォーメーション
【目的】

【実験方法】

【結果】

9/23
(目的) ベクターのアルカリミニプレップ、フェノクロ処理、制限酵素処理、ベクターのトランスフォーム、ライゲーション

(方法) まずくっつかない原因としてやっぱりベクターが悪いのではないかということで新しくプレートにpSB1C3をいれた大腸菌(XL1-Blue)をまいて様子を見てみた

そして昨日プレカルチャーしたものをアルカリミニプレした
その時二本だけバンドが見つかった。

電気泳動写真
<IMG src=" 2011.09.23_%E4%B8%AD%E5%B7%9D.JPG " width="240px" height="280px" border="0">

ライゲーションを下記のように行った

下記の組成に従って反応液を調整した

まず提出用ベクターの濃度を10pg/μlになるように希釈する
そして下の配合で行けるようにinsert156ng/μlの方を計算して希釈する
その後に下記の割合で配合していった

提出用ベクター:GFP＝1:10

insert	1.0 µl
vector	1.0µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total 6.0 µl

提出用ベクター:GFP＝1:20

insert	1.0 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total6.0µl

提出用ベクター:GFP＝1:40

insert	1.0 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total 6 µl

16°C、30minでincubateした
ライゲーション後、、形質転換を行い、その後にSOC培地300μlに注入し30分培養後プレートにまいた<BR

(結果) たまにバンドは出てくるが全体的に収率が悪いので原因を探ることにする
ベクターに問題があるのかもしれないことは大いに考えられるのがライゲーションはこれからも続けていくことになった
プレートはきれいだった
9/24
(目的)
pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノクロ処理、制限酵素処理、pSB1C3のゲル抽出,GFP制限酵素処理
(方法)
今回イソプロパノールが切れたので新しいのに代えてみたら格段に収率が上がった
これより収率が今まで悪かったのはイソプロパノールの劣化にも一理あると考えられた
pSB1C3のアルカリミニプレップ,フェノクロ処理をした後、下表に従って、37℃で一晩制限酵素処理を行った。そして以前PCRしたGFPの方も下記に従って制限酵素処理した。

ddH₂O	2 µl
BBa_E0240	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

そして昨日制限酵素処理したpSB1C3をゲル抽出した

<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用してゲルからpSB1C3のDNAを抽出した。

泳動後の写真
<IMG src=" 2011.09.24_%E3%82%B2%E3%83%AB%E6%8A%BD%E5%87%BA.JPG " width="250px" height="250px" border="0">
約2kbのところにバンドが見られた。

(結果) これでまたライゲーションをの効率を高められるようになった
試薬の劣化には注意する必要があることが分かった

9/25
(目的)
GFPのPCR,GFPのゲル抽出、GFPの濃度チェック
(方法)
昨日のGFPをゲル抽出して新たなインサートを作ることにした
<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用してゲルからpSB1C3のDNAを抽出した。

ゲル抽出の写真
<IMG src=" 2011.09.25_GFP%E3%82%B2%E3%83%AB%E6%8A%BD%E5%87%BA.JPG " width="250px" height="250px" border="0">
そして濃度チェックの電気泳動もかけた

1倍希釈	1µl
2倍希釈	1µl
4倍希釈	1µl
8倍希釈	1µl

そして今日もライゲーションをするためにインサートの不足が懸念されたのでPCRもかけた
PCR

PCR条件

10 µM Primer F	1.5 µl
10 µM Primer R	1.5 µl
GFP	1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus	5 µl
dNTPs	4 µl
MgSO₄	4 µl
ddH₂O	32 µl
KOD Plus	1 µl
	total 50 µl

Cycle条件

</td><td width="100px"> </td>

<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>95°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>30 Cycle</td></tr> <tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>48.5°C</td><td align=center>1min</td></tr> <tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr> <tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px"> </td></tr> </table> </td></tr> </table>
上記の組成に従って混ぜた
GFPのチェックは時間もないのですべて同じ条件より一つを選択して念のためにPCRチェックした
PCR増幅チェック
<IMG src=" 2011.09.25_GFP-PCR.JPG " width="250px" height="250px" border="0">

(結果)
GFPは増えていることが分かりゲル抽出からも70ng/μl程度のインサートが取れた

9/26

(目的)
ライゲーション、液体pSB1C3の制限酵素処理 (方法)
目的のものは十分にそろっているはずなのであとはライゲーションのみに力を入れた
また今日から液体状のpSB1C3も制限酵素処理し明日からライゲーションに活用することにした
制限酵素処理
下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。

Pre-Denature

95°C

30sec

ddH₂O	2 µl
BBa_E0240	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

次にライゲーションを下記のように行った

下記の組成に従って反応液を調整した

まず提出用ベクターの濃度を10pg/μlになるように希釈する
そして下の配合で行けるようにGFP70ng/μlの方とMLF60ng/μlを計算して1μlで下記の組成になるように希釈する
その後に下記の割合で配合していった

提出用ベクター:GFP＝1:10

insert	1.0 µl
vector	1.0µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total 6.0 µl

提出用ベクター:GFP＝1:20

insert	1.0 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total6.0µl

提出用ベクター:GFP＝1:40

insert	1.0 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total 6 µl

16°C、30minでincubateした
ライゲーション後、、形質転換を行い、その後にSOC培地300μlに注入し30分培養後プレートにまいた

(結果)
やっぱり生えてこなかった
おそらくベクターに問題があると考えられる

9/27
(目的)
新しいベクターでライゲーション (方法)
京大さんに頼んで使っている中で余っているpSB1C3を譲っていただきそれでもライゲーションをした

ライゲーションを下記のように行った

下記の組成に従って反応液を調整した

まず提出用ベクターの濃度を10pg/μlになるように希釈する
そして下の配合で行けるようにGFP70ng/μlの方とMLF60ng/μlを計算して1μlで下記の組成になるように希釈する
その後に下記の割合で配合していった

提出用ベクター:GFP＝1:10

insert	1.0 µl
vector	1.0µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total 6.0 µl

提出用ベクター:GFP＝1:20

insert	1.0 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total6.0µl

提出用ベクター:GFP＝1:40

insert	1.0 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total 6 µl

16°C、30minでincubateした
ライゲーション後、、形質転換を行い、その後にSOC培地300μlに注入し30分培養後プレートにまいた
(結果)
今回は液体からのPSB1C3は良くなかったが京大からのはコロニーがあったので大いに期待できた
ただMLFはコロニーらしきものもなく大いに心配する出来事だった

9/28
(目的)
ライゲーション,ライゲーション産物のプレカルチャー

(方法)
ライゲーションを下記のように行った

下記の組成に従って反応液を調整した

まず提出用ベクターの濃度を10pg/μlになるように希釈する
そして下の配合で行けるようにGFP70ng/μlの方とMLF60ng/μlを計算して1μlで下記の組成になるように希釈する
その後に下記の割合で配合していった

提出用ベクター:GFP＝1:10

insert	1.0 µl
vector	1.0µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total 6.0 µl

提出用ベクター:GFP＝1:20

insert	1.0 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total6.0µl

提出用ベクター:GFP＝1:40

insert	1.0 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total 6 µl

16°C、30minでincubateした
ライゲーション後、、形質転換を行い、その後にSOC培地300μlに注入し30分培養後プレートにまいた

そしてできていたコロニーを培養すべくプレカルチャーをした

(結果)
京大さんに頂いたものとライゲーションしたGFPのものにまたコロニーがあった。
そしてプレカルチャーしていたものも順調に増えていた

9/29

(目的)
ライゲーション産物のアルカリミニプレップ、一部を制限酵素処理、ライゲーション、 (方法)
ライゲーション産物をアルカリミニプレップした
そして一部をとって電気泳動することにした

ライゲーションもまた同様ににした
下記の組成に従って反応液を調整した

まず提出用ベクターの濃度を10pg/μlになるように希釈する
そして下の配合で行けるようにGFP70ng/μlの方とMLF60ng/μlを計算して1μlで下記の組成になるように希釈する
その後に下記の割合で配合していった

提出用ベクター:GFP＝1:10

insert	1.0 µl
vector	1.0µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total 6.0 µl

提出用ベクター:GFP＝1:20

insert	1.0 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total6.0µl

提出用ベクター:GFP＝1:40

insert	1.0 µl
vector	1.0 µl
10 x Buffer	2.5 µl
F4 ligase	0.5 µl
ddH₂O	1.0 µl
	total 6 µl

16°C、30minでincubateした
ライゲーション後、、形質転換を行い、その後にSOC培地300μlに注入し30分培養後プレートにまいた
(結果)
やはりライゲーションにおいてGFPはあってもMLFは存在しなかった
そしてパーツの一つ目は本日完成した

</p> </body> </html>

</div>

@@ Line 19: / Line 19: @@
 : After extracting DNA,I measured 5µl ,and diluted it for 20 times.
 : And I measured its density.
-:3.PCR reaction was carried out by using primers designed on August 30rd. The reaction conditions are summarized below.
+:3.PCR reaction was carried out by using primers designed on August 30th. The reaction conditions are summarized below.
 :<table border="0"><tr><td>