Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNoteJ/DIAP2-MALTJ9

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(9月12日)
(9月12日)
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:再度、違う条件下でアニーリングのテストを行った。
:再度、違う条件下でアニーリングのテストを行った。
:アニーリング 50.5°C
:アニーリング 50.5°C
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==''9月13日''==
==''9月13日''==

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9月1日

Member

武田


DIAP2について、以下の条件でPCRを行った。
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl or 4 µl
ddH2O33 µl or 31 µl
KOD+ polymelase1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cyle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C100sec
End4°Ckeep 
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


正しい位置にバンドが見られた。


9月5日

Member

横井川


1日に確認したDIAP2をフェノールクロロホルム処理し、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 μl
10 x H Buffer5 μl
Xho1 μl
 total 50 μl
37°Cで20時間静置した


9月6日

Member

横井川


1日に確認したDIAP2をフェノールクロロホルム処理し、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 μl
10 x M Buffer5 μl
Xba1 μl
 total 50 μl
37°Cで20時間静置した。


9月7日

Member

横井川


[http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx QIAquick Gel Extraction Kit]を使用してゲルからDIAP2のDNAを抽出した。


Results

バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。


9月12日

Member

松浪、横井川


DIAP2について以下のプライマーを用いて、以下の条件でPCRを行った。
F primer GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値    62 °C
R primer GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値    66.4°C
増幅サイズ  約1514 bp


PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl
ddH2O33 µl
KOD+ polymelase1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C1min40sec
End4°Ckeep 


再度、違う条件下でアニーリングのテストを行った。
アニーリング 50.5°C


9月13日

Member

松浪、横井川


12日のPCR産物が増幅しているか確かめるため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2・3レーン;DIAP2
期待される場所にバンドが見られた。


9月14日

Member

松浪、横井川


API2-MALT1について以下のプライマーを用いて、以下の条件でPCRを行った。
F primer GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
Tm値    57.8 °C
R primer GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値    56.5 °C
増幅サイズ  約3131 bp


PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling51.5°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


マーカー(1 Kbp)のみバンドが見られた。

9月15日

Member

松浪、横井川


API2-MALT1、DIAP2について、以下の条件でPCRを行った。
API2-MALT1
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling53°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 


DIAP2
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl
ddH2O33 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C1min 40sec
End4°Ckeep 
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


DIAP2のPCR産物を、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x H Buffer5 µl
Xho1 µl
 total 50 µl

37°Cで20時間静置した。
Results

泳動後の写真


左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2~5レーン;DIAP2、6~8レーン;API2-MALT1
DIAP2に関しては予想される位置にバンドが見られたが、API2-MALT1は見られなかった。


9月16日

Member

松浪、横井川


DIAP2のPCR産物を、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x M Buffer5 µl
Xba1 µl
 total 50 µl


9月17日

Member

松浪、横井川


制限酵素処理を行ったDIAP2のプラスミドを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


マーカー(1 Kbp)のバンドのみが見られた。制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなかった。


9月18日

Member

松浪


コンピテントセル(DH5α)を作成した。


9月19日

Member

松浪


コンピテントセル(DH5α)を作成した。


9月21日

Member

松浪


1.コンピテントセル(DH5α)を作成した。
2.DIAP2について、以下の条件でPCRを行った。
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl
ddH2O33 µl
KOD+ polymelase1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C1kb/min
End4°Ckeep 
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


DIAP2のPCR産物を、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x H Buffer5 µl
Xho1 µl
 total 50 µl


Results

1.ODを測定したが、OD=0.9を超えてしまった。
泳動後の写真


左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2~7レーン;DIAP2
全てのサンプルでPCRが成功した。


9月22日

Member

不明★


DIAP2のPCR産物を、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x M Buffer5 µl
Xba1 µl
 total 50 µl


9月23日

Member

松浪


制限酵素処理を行ったDIAP2のプラスミドを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


マーカー(1 Kbp)のみバンドが見られ、制限酵素処理を行ったDIAP2のサンプルはすべてバンドが見られなった。


9月25日

Member

松浪


コンピテントセル(DH5α)を作成した。


9月27日

Member

松浪


コンピテントセル(DH5α)を作成した。