Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNoteJ/DIAP2-MALTJ8

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8月8日

Member

松浪、横井川


API2-MALT1、DIAP2について以下のプライマーを用いて、以下の条件でPCRを行った。


API2-MALT1
F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
Tm値 57.8°C
R primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値 56.5°C
増幅サイズ  約3131 bp
DIAP2
F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値 69°C
R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値 66.4°C
増幅サイズ  約1514 bp


1.API2-MALT1
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling51.5°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 


2.DIAP2
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling56.9°C30sec
Extension72°C1min40sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 


8月9日

Member

松浪、横井川


1.PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
2.pUAST溶液のトランスフォーメーションを行った。


Results

1.泳動後の写真


1レーン;マーカー(1 Kbp)、2レーン;API2-MALT1、3レーン;DIAP2
2つとも予想される位置にバンドが確認されなかった。


2.コロニーの生育がみられた。


8月10日

Member

松浪


1.API2-MALT1、DIAP2について、8月8日と同じ条件でPCRを行った。
2.pUASTのプレカルチャー


Results

2.全てのサンプルに大腸菌の増殖がみられた。


8月11日

Member

松浪


pUAST flag vectorのアルカリミニプレップをした後、プラスミドの確認をするため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2~9レーン;pUAST、10レーン;flag、11レーン;API2-MALT1、12レーン;DIAP2
pUASTは予想される位置にバンドが確認されたが、API2-MALT1、DIAP2は確認されなかった。


8月12日

Member

松浪、横井川


1.pUAST flag vectorのアルカリミディプレップをした後、DNA濃度測定を行った。
2.プラスミドの確認をするため、電気泳動を行った。


Results

1.サンプル1、2の吸光度を測定した結果を以下に示す(表1)。


表1、サンプル1、2の吸光度の値
サンプル1
0.1890.2080.1920.1900.191
平均は0.194であった。
これより、サンプル1のDNA濃度は0.970 µg/µlであった。


サンプル2
0.2820.2760.2780.2690.269
平均は0.275でった。
これより、サンプル2のDNA濃度は1.37 µg/µlであった。


2.:泳動後の写真


左がマーカー(1kb)、右から順にサンプル1、サンプル2、flagである。
予想される位置にバンドが見られた。


8月15日

Member

松浪、横井川


API2-MALT1、DIAP2について、8月8日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
API2-MALT1
Anneling58.9°C
DIAP2
Anneling53°C
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2レーン;API2-MALT1、3レーン;DIAP2
API2-MALT1は予想される位置にバンドが確認されず、DIAP2は複数本のバンドが見られた。


8月16日

Member

松浪


API2-MALT1、DIAP2について、8月8日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
API2-MALT1
Anneling53°C
DIAP2
Anneling58.9°C
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2・3レーン;API2-MALT1、4レーン;DIAP2
3レーン目のAPI2-MALT1は2 Kbpと3 Kbpにバンドが見られた。DIAP2はプライマーの特異性を高めたが、期待される位置にバンドはでなかった。

8月17日

Member

松浪、横井川


API2-MALT1、DIAP2について、8月8日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
API2-MALT1
Anneling53.5°C
DIAP2
Anneling50.5°C
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


右から順に1レーン;マーカー、2・3レーン;API2-MALT1、4レーン;DIAP2
API2-MALT1は前回の条件でPCRしたが、前回より3 Kbpのバンドが薄くなった。DIAP2は予想された位置にバンドが見えなかった。

8月23日

Member

松浪


API2-MALT1、DIAP2について、8月8日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
API2-MALT1
Anneling53°C
DIAP2
Anneling50.5°C
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2レーン;API2-MALT1、3レーン;API2-MALT1、4レーン;DIAP2、5レーン;DIAP2
API2-MALT1についてDNAポリメラーゼを変更したが、期待されるバンドは見られなかった。

8月24日

Member

松浪


API2-MALT1について10、100倍希釈後、以下の条件でPCRを行った。
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling51.5°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


左から順に2レーン;マーカー、3~6レーン;API2-MALT1(10倍希釈)、8~11レーン;API2-MALT1(100倍希釈)
バンドは何も見られなかった。

8月25日

Member

松浪


API2-MALT1、DIAP2について、8月8日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
API2-MALT1
Anneling51.5°C
DIAP2
Anneling50.5°C
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2・3レーン;API2-MALT1、4・5レーン;DIAP2
API2-MALT1に関してバンドは見られなかった。DIAP2については予想される位置にバンドが見られた。

8月29日

Member

武田、横井川


25日に確認したDIAP2をフェノールクロロホルム処理し、
pUAST-flag vectorとともに、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x H Buffer5 µl
Xho1 µl
 total 50 µl
pUAST-flag vector
pUAST-flag vector(500 ng/µl)10 µl
ddH2O34 µl
10 x H Buffer5 µl
Xho1 µl
 total 50 µl

37°Cで20時間静置した。

8月30日

Member

武田、横井川


25日に確認したDIAP2をフェノールクロロホルム処理し、
pUAST-flag vectorとともに、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x M Buffer5 µl
Xba1 µl
 total 50 µl
pUAST-flag vector
pUAST-flag vector(500 ng/µl)10 μl
ddH2O34 µl
10 x H Buffer5 µl
Xho1 µl
 total 50 µl

37°Cで20時間静置した 。

8月31日

Member

武田、横井川


[http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx QIAquick Gel Extraction Kit]を使用してゲルからDIAP2のDNAとpUAST-flag vectorを抽出した。


Results

ゲル切り出し後の写真


pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375 ng/µlであった。
DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。