"
Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNoteJ/DIAP2-MALTJ8
From 2011.igem.org
(Difference between revisions)
(→８月３０日) |
|||
| Line 439: | Line 439: | ||
<br> | <br> | ||
| - | =='' | + | ==''８月３１日''== |
<b>Member</b> | <b>Member</b> | ||
<br> | <br> | ||
Latest revision as of 16:29, 5 October 2011
 |
|
| Home | Team | Project | Parts | Notebook | Safety | Human Practice | Attributions |
|---|
| Home > Notebook > Lab Note > August | Language：English/Japanese |
|---|
８月８日
Member
- 松浪、横井川
- API2-MALT1、DIAP2について以下のプライマーを用いて、以下の条件でPCRを行った。
- API2-MALT1
- F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
- Tm値 57.8°C
- R primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
- Tm値 56.5°C
- 増幅サイズ 約3131 bp
- F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
- DIAP2
- F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
- Tm値 69°C
- R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
- Tm値 66.4°C
- 増幅サイズ 約1514 bp
- F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
- 1.API2-MALT1
PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl total 20 µl Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 51.5°C 30sec Extension 72°C 3min20sec +Extension 72°C 10min End 4°C keep
- 2.DIAP2
PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl total 20 µl Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 56.9°C 30sec Extension 72°C 1min40sec +Extension 72°C 10min End 4°C keep
８月９日
Member
- 松浪、横井川
- 1.PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
- 2.pUAST溶液のトランスフォーメーションを行った。
Results
- 1.泳動後の写真
-
- 1レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；DIAP2
- 2つとも予想される位置にバンドが確認されなかった。
- 2.コロニーの生育がみられた。
８月１０日
Member
- 松浪
- 1.API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でPCRを行った。
- 2.pUASTのプレカルチャー
Results
- 2.全てのサンプルに大腸菌の増殖がみられた。
８月１１日
Member
- 松浪
- pUAST flag vectorのアルカリミニプレップをした後、プラスミドの確認をするため、電気泳動を行った。
Results
- 泳動後の写真
-
- 左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～9レーン；pUAST、10レーン；flag、11レーン；API2-MALT1、12レーン；DIAP2
- pUASTは予想される位置にバンドが確認されたが、API2-MALT1、DIAP2は確認されなかった。
８月１２日
Member
- 松浪、横井川
- 1.pUAST flag vectorのアルカリミディプレップをした後、DNA濃度測定を行った。
- 2.プラスミドの確認をするため、電気泳動を行った。
Results
- 1.サンプル1、2の吸光度を測定した結果を以下に示す（表1）。
- 表1、サンプル1、2の吸光度の値
- サンプル1
0.189 0.208 0.192 0.190 0.191 - 平均は0.194であった。
- これより、サンプル1のDNA濃度は0.970 µg/µlであった。
- サンプル2
0.282 0.276 0.278 0.269 0.269 - 平均は0.275でった。
- これより、サンプル2のDNA濃度は1.37 µg/µlであった。
2.:泳動後の写真
- 左がマーカー(1kb)、右から順にサンプル1、サンプル2、flagである。
- 予想される位置にバンドが見られた。
８月１５日
Member
- 松浪、横井川
- API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
- API2-MALT1
Anneling 58.9°C
- DIAP2
Anneling 53°C
- PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
Results
- 泳動後の写真
-
- 左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；DIAP2
- API2-MALT1は予想される位置にバンドが確認されず、DIAP2は複数本のバンドが見られた。
８月１６日
Member
- 松浪
- API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
- API2-MALT1
Anneling 53°C
- DIAP2
Anneling 58.9°C
- PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
Results
- 泳動後の写真
-
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2
3レーン目のAPI2-MALT1は2 Kbpと3 Kbpにバンドが見られた。DIAP2はプライマーの特異性を高めたが、期待される位置にバンドはでなかった。
８月１７日
Member
- 松浪、横井川
- API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
- API2-MALT1
Anneling 53.5°C
- DIAP2
Anneling 50.5°C
- PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
Results
- 泳動後の写真
-
右から順に1レーン；マーカー、2・3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2
API2-MALT1は前回の条件でPCRしたが、前回より3 Kbpのバンドが薄くなった。DIAP2は予想された位置にバンドが見えなかった。
８月２３日
Member
- 松浪
- API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
- API2-MALT1
Anneling 53°C
- DIAP2
Anneling 50.5°C
- PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
Results
- 泳動後の写真
-
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2、5レーン；DIAP2
API2-MALT1についてDNAポリメラーゼを変更したが、期待されるバンドは見られなかった。
８月２４日
Member
- 松浪
- API2-MALT1について10、100倍希釈後、以下の条件でPCRを行った。
PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl total 20 µl Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 51.5°C 30sec Extension 72°C 3min20sec +Extension 72°C 10min End 4°C keep
- PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
Results
- 泳動後の写真
-
左から順に2レーン；マーカー、3～6レーン；API2-MALT1（10倍希釈）、8～11レーン；API2-MALT1（100倍希釈）
バンドは何も見られなかった。
８月２５日
Member
- 松浪
- API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
- API2-MALT1
Anneling 51.5°C
- DIAP2
Anneling 50.5°C
- PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
Results
- 泳動後の写真
-
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；API2-MALT1、4・5レーン；DIAP2
API2-MALT1に関してバンドは見られなかった。DIAP2については予想される位置にバンドが見られた。
８月２９日
Member
- 武田、横井川
- 25日に確認したDIAP2をフェノールクロロホルム処理し、
- pUAST-flag vectorとともに、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
- DIAP2
DIAP2 PCR産物 in ddH2O 44 µl 10 x H Buffer 5 µl XhoⅠ 1 µl total 50 µl pUAST-flag vector pUAST-flag vector(500 ng/µl) 10 µl ddH2O 34 µl 10 x H Buffer 5 µl XhoⅠ 1 µl total 50 µl
37°Cで20時間静置した。
８月３０日
Member
- 武田、横井川
- 25日に確認したDIAP2をフェノールクロロホルム処理し、
- pUAST-flag vectorとともに、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2 PCR産物 in ddH2O 44 µl 10 x M Buffer 5 µl XbaⅠ 1 µl total 50 µl pUAST-flag vector pUAST-flag vector(500 ng/µl) 10 μl ddH2O 34 µl 10 x H Buffer 5 µl XhoⅠ 1 µl total 50 µl
37°Cで20時間静置した 。
８月３１日
Member
- 武田、横井川
- [http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx QIAquick Gel Extraction Kit]を使用してゲルからDIAP2のDNAとpUAST-flag vectorを抽出した。
Results
- ゲル切り出し後の写真
-
- pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375 ng/µlであった。
- DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。
