Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNoteJ/DIAP2-MALT8

From 2011.igem.org

(Difference between revisions)
Line 13: Line 13:
<b>Member</b>
<b>Member</b>
<br>
<br>
-
:松浪、横井川
+
:Matsunami, Yokoigawa
<br>
<br>
-
:API2-MALT1、DIAP2について以下のプライマーを用いて、以下の条件でPCRを行った。
+
:To amplify API2-MALT1 cDNA and DIAP2cDNA, PCR reactions were carried out by using the following primers and under the following conditions.
<br>
<br>
:API2-MALT1
:API2-MALT1
::F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT<br>
::F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT<br>
-
::Tm値 57.8°C<br>
+
::Tm value 57.8°C<br>
::R primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA<br>
::R primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA<br>
-
::Tm値 56.5°C<br>
+
::Tm value 56.5°C<br>
-
::増幅サイズ  約3131 bp<br>
+
::amplicon size  3131 bp<br>
:DIAP2
:DIAP2
::F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT<br>
::F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT<br>
-
::Tm値 69°C<br>
+
::Tm value 69°C<br>
::R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA<br>
::R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA<br>
-
::Tm値 66.4°C<br>
+
::Tm value 66.4°C<br>
-
::増幅サイズ  約1514 bp
+
::amplicon size  1514 bp
<br>
<br>
Line 35: Line 35:
:<table border="0"><tr><td>
:<table border="0"><tr><td>
:<table border="0" width="150px">
:<table border="0" width="150px">
-
:<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+
:<tr><td align=center>PCR reaction</td></tr>
:</table>
:</table>
:<table border=1 width="250px">
:<table border=1 width="250px">
Line 49: Line 49:
:</td><TD></TD><TD></TD><td>
:</td><TD></TD><TD></TD><td>
:<table border="0" width="100px">
:<table border="0" width="100px">
-
:<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+
:<tr><td align=center>Cycle</td></tr>
:</table>
:</table>
:<table border=1 width="400px">
:<table border=1 width="400px">
Line 65: Line 65:
:<table border="0"><tr><td>
:<table border="0"><tr><td>
:<table border="0" width="150px">
:<table border="0" width="150px">
-
:<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+
:<tr><td align=center>PCR reaction</td></tr>
:</table>
:</table>
:<table border=1 width="250px">
:<table border=1 width="250px">
Line 79: Line 79:
:</td><TD></TD><TD></TD><td>
:</td><TD></TD><TD></TD><td>
:<table border="0" width="100px">
:<table border="0" width="100px">
-
:<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+
:<tr><td align=center>Cycle</td></tr>
:</table>
:</table>
:<table border=1 width="400px">
:<table border=1 width="400px">
Line 96: Line 96:
<b>Member</b>
<b>Member</b>
<br>
<br>
-
:松浪、横井川
+
:Matsunami, Yokoigawa
<br>
<br>
-
:1.PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
+
:1. We carried out agarose gel electrophoresis to detect the PCR products.
-
:2.pUAST溶液のトランスフォーメーションを行った。
+
:2. We transformed E. coli XL-1 blue with the plasmid pUAST-flag.
<br>
<br>
<b>Results</b>
<b>Results</b>
-
:1.泳動後の写真<BR>
+
:1. Image of the agarose gel. <BR>
:<html><body>
:<html><body>
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/b/bc/2011.08.09_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0">
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/b/bc/2011.08.09_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0">
</body></html>
</body></html>
<br>
<br>
-
:1レーン;マーカー(1 Kbp)、2レーン;API2-MALT1、3レーン;DIAP2
+
:Lane 1;size marker(1 kbp ladder)
-
:2つとも予想される位置にバンドが確認されなかった。
+
:Lane 2;the amplified API2-MALT1 cDNA fragment
 +
:Lane 3;the amplified DIAP2 cDNA fragment
 +
 
 +
:Sizes of the fragments were different from the expected sizes.
<br>
<br>
-
:2.コロニーの生育がみられた。
+
:2. The transformed bacterial colonies were detected.
<br>
<br>
Line 116: Line 119:
<b>Member</b>
<b>Member</b>
<br>
<br>
-
:松浪
+
:Matsunami
<br>
<br>
-
:1.API2-MALT1、DIAP2について、8月8日と同じ条件でPCRを行った。
+
:1. I have repeated the PCR reactions to amplify API2-MALT1 cDNA and DIAP2 cDNA under the same conditions as those carried out on 8th, August.
-
:2.pUASTのプレカルチャー
+
:2. I picked up the colonies and grew them in liquid culture.
<br>
<br>
<b>Results</b>
<b>Results</b>
-
:2.全てのサンプルに大腸菌の増殖がみられた。
+
:2. I have successfully grown the transformed bacteria.
<br>
<br>

Revision as of 16:06, 5 October 2011



Home Team Project Parts Notebook Safety Human Practice Attributions


Home > Notebook > Lab Note > August Language:English/Japanese

8月8日

Member

Matsunami, Yokoigawa


To amplify API2-MALT1 cDNA and DIAP2cDNA, PCR reactions were carried out by using the following primers and under the following conditions.


API2-MALT1
F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
Tm value 57.8°C
R primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm value 56.5°C
amplicon size  3131 bp
DIAP2
F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm value 69°C
R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm value 66.4°C
amplicon size  1514 bp


1.API2-MALT1
PCR reaction
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling51.5°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 


2.DIAP2
PCR reaction
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling56.9°C30sec
Extension72°C1min40sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 


8月9日

Member

Matsunami, Yokoigawa


1. We carried out agarose gel electrophoresis to detect the PCR products.
2. We transformed E. coli XL-1 blue with the plasmid pUAST-flag.


Results

1. Image of the agarose gel.


Lane 1;size marker(1 kbp ladder)
Lane 2;the amplified API2-MALT1 cDNA fragment
Lane 3;the amplified DIAP2 cDNA fragment
Sizes of the fragments were different from the expected sizes.


2. The transformed bacterial colonies were detected.


8月10日

Member

Matsunami


1. I have repeated the PCR reactions to amplify API2-MALT1 cDNA and DIAP2 cDNA under the same conditions as those carried out on 8th, August.
2. I picked up the colonies and grew them in liquid culture.


Results

2. I have successfully grown the transformed bacteria.


8月11日

Member

松浪


pUAST flag vectorのアルカリミニプレップをした後、プラスミドの確認をするため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2~9レーン;pUAST、10レーン;flag、11レーン;API2-MALT1、12レーン;DIAP2
pUASTは予想される位置にバンドが確認されたが、API2-MALT1、DIAP2は確認されなかった。


8月12日

Member

松浪、横井川


1.pUAST flag vectorのアルカリミディプレップをした後、DNA濃度測定を行った。
2.プラスミドの確認をするため、電気泳動を行った。


Results

1.サンプル1、2の吸光度を測定した結果を以下に示す(表1)。


表1、サンプル1、2の吸光度の値
サンプル1
0.1890.2080.1920.1900.191
平均は0.194であった。
これより、サンプル1のDNA濃度は0.970 µg/µlであった。


サンプル2
0.2820.2760.2780.2690.269
平均は0.275でった。
これより、サンプル2のDNA濃度は1.37 µg/µlであった。


2.:泳動後の写真


左がマーカー(1kb)、右から順にサンプル1、サンプル2、flagである。
予想される位置にバンドが見られた。


8月15日

Member

松浪、横井川


API2-MALT1、DIAP2について、8月8日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
API2-MALT1
Anneling58.9°C
DIAP2
Anneling53°C
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2レーン;API2-MALT1、3レーン;DIAP2
API2-MALT1は予想される位置にバンドが確認されず、DIAP2は複数本のバンドが見られた。


8月16日

Member

松浪


API2-MALT1、DIAP2について、8月8日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
API2-MALT1
Anneling53°C
DIAP2
Anneling58.9°C
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2・3レーン;API2-MALT1、4レーン;DIAP2
3レーン目のAPI2-MALT1は2 Kbpと3 Kbpにバンドが見られた。DIAP2はプライマーの特異性を高めたが、期待される位置にバンドはでなかった。

8月17日

Member

松浪、横井川


API2-MALT1、DIAP2について、8月8日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
API2-MALT1
Anneling53.5°C
DIAP2
Anneling50.5°C
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


右から順に1レーン;マーカー、2・3レーン;API2-MALT1、4レーン;DIAP2
API2-MALT1は前回の条件でPCRしたが、前回より3 Kbpのバンドが薄くなった。DIAP2は予想された位置にバンドが見えなかった。

8月23日

Member

松浪


API2-MALT1、DIAP2について、8月8日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
API2-MALT1
Anneling53°C
DIAP2
Anneling50.5°C
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2レーン;API2-MALT1、3レーン;API2-MALT1、4レーン;DIAP2、5レーン;DIAP2
API2-MALT1についてDNAポリメラーゼを変更したが、期待されるバンドは見られなかった。

8月24日

Member

松浪


API2-MALT1について10、100倍希釈後、以下の条件でPCRを行った。
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling51.5°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


左から順に2レーン;マーカー、3~6レーン;API2-MALT1(10倍希釈)、8~11レーン;API2-MALT1(100倍希釈)
バンドは何も見られなかった。

8月25日

Member

松浪


API2-MALT1、DIAP2について、8月8日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
API2-MALT1
Anneling51.5°C
DIAP2
Anneling50.5°C
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2・3レーン;API2-MALT1、4・5レーン;DIAP2
API2-MALT1に関してバンドは見られなかった。DIAP2については予想される位置にバンドが見られた。

8月29日

Member

武田、横井川


25日に確認したDIAP2をフェノールクロロホルム処理し、
pUAST-flag vectorとともに、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x H Buffer5 µl
Xho1 µl
 total 50 µl
pUAST-flag vector
pUAST-flag vector(500 ng/µl)10 µl
ddH2O34 µl
10 x H Buffer5 µl
Xho1 µl
 total 50 µl

37°Cで20時間静置した。

8月30日

Member

武田、横井川


25日に確認したDIAP2をフェノールクロロホルム処理し、
pUAST-flag vectorとともに、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x M Buffer5 µl
Xba1 µl
 total 50 µl
pUAST-flag vector
pUAST-flag vector(500 ng/µl)10 μl
ddH2O34 µl
10 x H Buffer5 µl
Xho1 µl
 total 50 µl

37°Cで20時間静置した 。

8月30日

Member

武田、横井川


[http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx QIAquick Gel Extraction Kit]を使用してゲルからDIAP2のDNAとpUAST-flag vectorを抽出した。


Results

ゲル切り出し後の写真


pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375 ng/µlであった。
DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。