Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNoteJ/DIAP2-MALT8
From 2011.igem.org
Line 13: | Line 13: | ||
<b>Member</b> | <b>Member</b> | ||
<br> | <br> | ||
- | : | + | :Matsunami, Yokoigawa |
<br> | <br> | ||
- | :API2- | + | :To amplify API2-MALT1 cDNA and DIAP2cDNA, PCR reactions were carried out by using the following primers and under the following conditions. |
<br> | <br> | ||
:API2-MALT1 | :API2-MALT1 | ||
::F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT<br> | ::F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT<br> | ||
- | :: | + | ::Tm value 57.8°C<br> |
::R primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA<br> | ::R primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA<br> | ||
- | :: | + | ::Tm value 56.5°C<br> |
- | :: | + | ::amplicon size 3131 bp<br> |
:DIAP2 | :DIAP2 | ||
::F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT<br> | ::F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT<br> | ||
- | :: | + | ::Tm value 69°C<br> |
::R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA<br> | ::R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA<br> | ||
- | :: | + | ::Tm value 66.4°C<br> |
- | :: | + | ::amplicon size 1514 bp |
<br> | <br> | ||
Line 35: | Line 35: | ||
:<table border="0"><tr><td> | :<table border="0"><tr><td> | ||
:<table border="0" width="150px"> | :<table border="0" width="150px"> | ||
- | :<tr><td align=center> | + | :<tr><td align=center>PCR reaction</td></tr> |
:</table> | :</table> | ||
:<table border=1 width="250px"> | :<table border=1 width="250px"> | ||
Line 49: | Line 49: | ||
:</td><TD></TD><TD></TD><td> | :</td><TD></TD><TD></TD><td> | ||
:<table border="0" width="100px"> | :<table border="0" width="100px"> | ||
- | :<tr><td align=center> | + | :<tr><td align=center>Cycle</td></tr> |
:</table> | :</table> | ||
:<table border=1 width="400px"> | :<table border=1 width="400px"> | ||
Line 65: | Line 65: | ||
:<table border="0"><tr><td> | :<table border="0"><tr><td> | ||
:<table border="0" width="150px"> | :<table border="0" width="150px"> | ||
- | :<tr><td align=center> | + | :<tr><td align=center>PCR reaction</td></tr> |
:</table> | :</table> | ||
:<table border=1 width="250px"> | :<table border=1 width="250px"> | ||
Line 79: | Line 79: | ||
:</td><TD></TD><TD></TD><td> | :</td><TD></TD><TD></TD><td> | ||
:<table border="0" width="100px"> | :<table border="0" width="100px"> | ||
- | :<tr><td align=center> | + | :<tr><td align=center>Cycle</td></tr> |
:</table> | :</table> | ||
:<table border=1 width="400px"> | :<table border=1 width="400px"> | ||
Line 96: | Line 96: | ||
<b>Member</b> | <b>Member</b> | ||
<br> | <br> | ||
- | : | + | :Matsunami, Yokoigawa |
<br> | <br> | ||
- | :1. | + | :1. We carried out agarose gel electrophoresis to detect the PCR products. |
- | :2. | + | :2. We transformed E. coli XL-1 blue with the plasmid pUAST-flag. |
<br> | <br> | ||
<b>Results</b> | <b>Results</b> | ||
- | :1. | + | :1. Image of the agarose gel. <BR> |
:<html><body> | :<html><body> | ||
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/b/bc/2011.08.09_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"> | <IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/b/bc/2011.08.09_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0"> | ||
</body></html> | </body></html> | ||
<br> | <br> | ||
- | : | + | :Lane 1;size marker(1 kbp ladder) |
- | : | + | :Lane 2;the amplified API2-MALT1 cDNA fragment |
+ | :Lane 3;the amplified DIAP2 cDNA fragment | ||
+ | |||
+ | :Sizes of the fragments were different from the expected sizes. | ||
<br> | <br> | ||
- | :2. | + | :2. The transformed bacterial colonies were detected. |
<br> | <br> | ||
Line 116: | Line 119: | ||
<b>Member</b> | <b>Member</b> | ||
<br> | <br> | ||
- | : | + | :Matsunami |
<br> | <br> | ||
- | :1.API2- | + | :1. I have repeated the PCR reactions to amplify API2-MALT1 cDNA and DIAP2 cDNA under the same conditions as those carried out on 8th, August. |
- | :2. | + | :2. I picked up the colonies and grew them in liquid culture. |
<br> | <br> | ||
<b>Results</b> | <b>Results</b> | ||
- | :2. | + | :2. I have successfully grown the transformed bacteria. |
<br> | <br> | ||
Revision as of 16:06, 5 October 2011
Home | Team | Project | Parts | Notebook | Safety | Human Practice | Attributions |
---|
Home > Notebook > Lab Note > August | Language:English/Japanese |
---|
8月8日
Member
- Matsunami, Yokoigawa
- To amplify API2-MALT1 cDNA and DIAP2cDNA, PCR reactions were carried out by using the following primers and under the following conditions.
- API2-MALT1
- F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
- Tm value 57.8°C
- R primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
- Tm value 56.5°C
- amplicon size 3131 bp
- F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
- DIAP2
- F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
- Tm value 69°C
- R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
- Tm value 66.4°C
- amplicon size 1514 bp
- F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
- 1.API2-MALT1
PCR reaction 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl total 20 µl Cycle Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 51.5°C 30sec Extension 72°C 3min20sec +Extension 72°C 10min End 4°C keep
- 2.DIAP2
PCR reaction 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl total 20 µl Cycle Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 56.9°C 30sec Extension 72°C 1min40sec +Extension 72°C 10min End 4°C keep
8月9日
Member
- Matsunami, Yokoigawa
- 1. We carried out agarose gel electrophoresis to detect the PCR products.
- 2. We transformed E. coli XL-1 blue with the plasmid pUAST-flag.
Results
- 1. Image of the agarose gel.
- Lane 1;size marker(1 kbp ladder)
- Lane 2;the amplified API2-MALT1 cDNA fragment
- Lane 3;the amplified DIAP2 cDNA fragment
- Sizes of the fragments were different from the expected sizes.
- 2. The transformed bacterial colonies were detected.
8月10日
Member
- Matsunami
- 1. I have repeated the PCR reactions to amplify API2-MALT1 cDNA and DIAP2 cDNA under the same conditions as those carried out on 8th, August.
- 2. I picked up the colonies and grew them in liquid culture.
Results
- 2. I have successfully grown the transformed bacteria.
8月11日
Member
- 松浪
- pUAST flag vectorのアルカリミニプレップをした後、プラスミドの確認をするため、電気泳動を行った。
Results
- 泳動後の写真
- 左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2~9レーン;pUAST、10レーン;flag、11レーン;API2-MALT1、12レーン;DIAP2
- pUASTは予想される位置にバンドが確認されたが、API2-MALT1、DIAP2は確認されなかった。
8月12日
Member
- 松浪、横井川
- 1.pUAST flag vectorのアルカリミディプレップをした後、DNA濃度測定を行った。
- 2.プラスミドの確認をするため、電気泳動を行った。
Results
- 1.サンプル1、2の吸光度を測定した結果を以下に示す(表1)。
- 表1、サンプル1、2の吸光度の値
- サンプル1
0.189 0.208 0.192 0.190 0.191 - 平均は0.194であった。
- これより、サンプル1のDNA濃度は0.970 µg/µlであった。
- サンプル2
0.282 0.276 0.278 0.269 0.269 - 平均は0.275でった。
- これより、サンプル2のDNA濃度は1.37 µg/µlであった。
2.:泳動後の写真
- 左がマーカー(1kb)、右から順にサンプル1、サンプル2、flagである。
- 予想される位置にバンドが見られた。
8月15日
Member
- 松浪、横井川
- API2-MALT1、DIAP2について、8月8日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
- API2-MALT1
Anneling 58.9°C
- DIAP2
Anneling 53°C
- PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
Results
- 泳動後の写真
- 左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2レーン;API2-MALT1、3レーン;DIAP2
- API2-MALT1は予想される位置にバンドが確認されず、DIAP2は複数本のバンドが見られた。
8月16日
Member
- 松浪
- API2-MALT1、DIAP2について、8月8日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
- API2-MALT1
Anneling 53°C
- DIAP2
Anneling 58.9°C
- PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
Results
- 泳動後の写真
左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2・3レーン;API2-MALT1、4レーン;DIAP2
3レーン目のAPI2-MALT1は2 Kbpと3 Kbpにバンドが見られた。DIAP2はプライマーの特異性を高めたが、期待される位置にバンドはでなかった。
8月17日
Member
- 松浪、横井川
- API2-MALT1、DIAP2について、8月8日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
- API2-MALT1
Anneling 53.5°C
- DIAP2
Anneling 50.5°C
- PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
Results
- 泳動後の写真
右から順に1レーン;マーカー、2・3レーン;API2-MALT1、4レーン;DIAP2
API2-MALT1は前回の条件でPCRしたが、前回より3 Kbpのバンドが薄くなった。DIAP2は予想された位置にバンドが見えなかった。
8月23日
Member
- 松浪
- API2-MALT1、DIAP2について、8月8日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
- API2-MALT1
Anneling 53°C
- DIAP2
Anneling 50.5°C
- PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
Results
- 泳動後の写真
左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2レーン;API2-MALT1、3レーン;API2-MALT1、4レーン;DIAP2、5レーン;DIAP2
API2-MALT1についてDNAポリメラーゼを変更したが、期待されるバンドは見られなかった。
8月24日
Member
- 松浪
- API2-MALT1について10、100倍希釈後、以下の条件でPCRを行った。
PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl total 20 µl Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 51.5°C 30sec Extension 72°C 3min20sec +Extension 72°C 10min End 4°C keep
- PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
Results
- 泳動後の写真
左から順に2レーン;マーカー、3~6レーン;API2-MALT1(10倍希釈)、8~11レーン;API2-MALT1(100倍希釈)
バンドは何も見られなかった。
8月25日
Member
- 松浪
- API2-MALT1、DIAP2について、8月8日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
- API2-MALT1
Anneling 51.5°C
- DIAP2
Anneling 50.5°C
- PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
Results
- 泳動後の写真
左から順に1レーン;マーカー(1 Kbp)、2・3レーン;API2-MALT1、4・5レーン;DIAP2
API2-MALT1に関してバンドは見られなかった。DIAP2については予想される位置にバンドが見られた。
8月29日
Member
- 武田、横井川
- 25日に確認したDIAP2をフェノールクロロホルム処理し、
- pUAST-flag vectorとともに、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
- DIAP2
DIAP2 PCR産物 in ddH2O 44 µl 10 x H Buffer 5 µl XhoⅠ 1 µl total 50 µl pUAST-flag vector pUAST-flag vector(500 ng/µl) 10 µl ddH2O 34 µl 10 x H Buffer 5 µl XhoⅠ 1 µl total 50 µl
37°Cで20時間静置した。
8月30日
Member
- 武田、横井川
- 25日に確認したDIAP2をフェノールクロロホルム処理し、
- pUAST-flag vectorとともに、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2 PCR産物 in ddH2O 44 µl 10 x M Buffer 5 µl XbaⅠ 1 µl total 50 µl pUAST-flag vector pUAST-flag vector(500 ng/µl) 10 μl ddH2O 34 µl 10 x H Buffer 5 µl XhoⅠ 1 µl total 50 µl
37°Cで20時間静置した 。
8月30日
Member
- 武田、横井川
- [http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx QIAquick Gel Extraction Kit]を使用してゲルからDIAP2のDNAとpUAST-flag vectorを抽出した。
Results
- ゲル切り出し後の写真
- pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375 ng/µlであった。
- DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。