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Team:LMU-Munich/intern/Status
From 2011.igem.org
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! für Konstrukt | ! für Konstrukt | ||
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| - | | | + | | pnikA-E,N,X-fwd |
| GCAGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG TTAAGCCTTGCGATCTGCACC | | GCAGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG TTAAGCCTTGCGATCTGCACC | ||
| 55°C | | 55°C | ||
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| Pnik | | Pnik | ||
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| - | | | + | | pnikA-S-rev |
| CCGCTACTAGTA GACGATAAAAGACGCACAAGCC | | CCGCTACTAGTA GACGATAAAAGACGCACAAGCC | ||
| 55°C | | 55°C | ||
Revision as of 21:17, 15 June 2011
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Contents |
Aktueller Stand der Recherche
| Metall | Kontakt hergestellt | Plasmid verfuegbar | Plasmid Sequenz bekannt | Klonierungsstrategie | Primerdesign |
|---|---|---|---|---|---|
| Zn?+ | Ja | Ja | Noch nicht | PCR moeglich | nein |
| Hg | Ja | Ja | Noch nicht | PCR moeglich | nein |
| Cd | Ja | Ja | Noch nicht | PCR moeglich | nein |
| As3+ | Antwortet nicht, aktuelle Kontaktdaten | Nicht benötigt | nein | PCR moeglich | nein |
| CrO42- / Cr2O72- | Ja | Ja | nein | PCR moeglich | nein |
| Fe2+ (Mn2+) | Ja | Fur ja, norB leider verloren | nein, aber nicht nötig | PCR moeglich | Ja |
| jedes was bei Bindung zum Repressor wird | ja | ja | nein, aber nicht nötig | PCR moeglich | ja |
| Ni2+ NikR | ja | ||||
| nein | PCR moeglich | ja | |||
| Ni2+ RcnR | ja (Chivers) | ||||
| nein | PCR moeglich | ja | |||
| Pb2+ | Antwortet noch nicht, späte Kontaktaufnahme | Abhängig von Antwort | nein | PCR möglich | steht |
Übersicht Zn; Hg; Cd
| Metall | Kontakt hergestellt | Plasmid verfuegbar | Plasmid Sequenz bekannt | Klonierungsstrategie | Primerdesign |
|---|---|---|---|---|---|
| Zn?+ | Ja | Ja | Noch nicht | PCR moeglich | nein |
| Hg | Ja | Ja | Noch nicht | PCR moeglich | nein |
| Cd | Ja | Ja | Noch nicht | PCR moeglich | nein |
Bitte, bitte, bitte, editiere mich!!!!!!!!!!!!!!!!
Übersicht Arsen/Antimon
Bitte vervollstaendigt die Tabelle.
| Metall | Kontakt hergestellt | Plasmid verfuegbar | Plasmid Sequenz bekannt | Klonierungsstrategie | Primerdesign |
|---|---|---|---|---|---|
| As3+ | Antwortet nicht, aktuelle Kontaktdaten | Nicht benötigt | nein | PCR moeglich | nein |
Details
evtl Probleme wegen Patent.
As3+
Beschreibung des Sensors
Uebersicht Chrom
Bitte vervollstaendigt die Tabelle.
| Metall | Kontakt hergestellt | Plasmid verfuegbar | Plasmid Sequenz bekannt | Klonierungsstrategie | Primerdesign |
|---|---|---|---|---|---|
| CrO42- / Cr2O72- | Ja | Ja | nein | PCR moeglich | nein |
Details
CrO42- / Cr2O72-
Beschreibung des Sensors
- 1998 wurde ein Plasmid (pEBZ141) entwickelt, welches eine Fusion ist von dem Chrom-Resistenz Gen chr und einer Luciferase ist.
- chr kodiert unter anderem fuer einen Chromtransporter.
- Der Sensor ist sehr selektiv (effektiv reagiert er nur auf Chromat und Dichromat) und scheint zuverlaessig zu arbeiten.
- Fuer eine hohe Effizienz wird ein bestimmter Stamm von CH34 benoetigt (AE104), welcher kein naturliches Plasmid besitzt.
Problembeschreibung
- Ich habe den Kontakt mit der Gruppe hergestellt. Prinzipiell koennen wir das Plasmid haben, wir brauchen jedoch die Zustimmung von Bayer. Anfrage wurde versendet (Mittwoch), bisher noch keine Antwort.
- Ein weiteres Problem koennte der CH34 Stamm sein. Angeblich wird eine Einstufung nach S2 diskutiert und der Prof. kann die entsprechenden Staemme deswegeb nicht verschicken. Wir haben ein S2 Labor zur Verfuegung. Noch keine Ruecksprache gehalten. Warte auf Bayer.
Literatur
- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=pEBZ141
Sequenzen
- Die Sequenz des natuerlichen Plasmids (pMOL28) von welchem chr urspruenglich kloniert wurde.
- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/291434858?report=fasta
- chr liegt auf dem - Strang zwischen den Basenpaaren 49924 und 52146.
Klonierungsstrategie
Mittels PCR chrBA'::lux vom Plasmid klonieren und in Biobrick einfuegen. Ich habe nach der Sequenz von pEBZ141 noch nicht gefragt.
Primerdesign
Stop-Codon sei rot Überhang sei durch ein Leerzeichen getrennt
| Primer | Sequenz | Tm | Schnittstellen | Besonderheiten | für Konstrukt |
|---|---|---|---|---|---|
| ChrBAfor | AgtcgccggcAAGAAGGAGATATACC ATGAACGCTCTCCCATCCTC | 54°C | NgoMIV | liegt auf Plasmid | ChrBA |
| ChrBArev | agtcactagtattaaccgg tta TCAGTGATGCAACAACGGATAGG | 56°C | AgeI, SpeI | liegt auf Plasmid | ChrBA |
| Name3f | AAA | 60°C | E,N,X | Mutagenierung | NikR |
| Name4r | AAA | 60°C | S,(N,P) | Mutagenierung | NikR |
Sonstiges
Uebersicht Eisen
| Metall | Kontakt hergestellt | Plasmid verfuegbar | Plasmid Sequenz bekannt | Klonierungsstrategie | Primerdesign |
|---|---|---|---|---|---|
| Fe2+ (Mn2+) | Ja | Fur ja, norB leider verloren | nein, aber nicht nötig | PCR moeglich | Ja |
Details
Fe2+ (Mn2+)
Beschreibung des Sensors
- norB als Promotor. Wobei Fur als Aktivator bei Eisenbindung wirkt
- eventuel N. meningitidis Fur benötigt, auch bereits angefragt (bereits angekommen)
- dabei ein Fur deletierten E.coli Stamm nötig, auch bereits angefragt (bereits angekommen)
Problembeschreibung
- N.meningitidis muss benutzt werden um norB herauszuholen (Pettenkofer anfragen ...)
Literatur
- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15130126
Sequenzen
- norB:CGGCAAATCAGGCAAAGGCAGGGTAGTTGCCGACTAAAGAATAATGATAGTTATTATCATATATGTATTTGTTTTATATG
TGAGTTTCTTTGAACAAATGTTTATTTGCGCGGTAAACCGTGCTACAATCTTTAACATTCATATTTTGTGAATTTTAATC CACTATATATTAAAAGGAGCTCTCAAAATG
- Fur N.meningitidis:ATGGAAAAATTCAACAATATTGCACAACTGAAAGACAGCGGTCTGAAGGTTACCGGCCCG
CGTTTGAAGATTTTGGATTTGTTCGAGACGCATGCGGAAGAGCATTTGAGTGCGGAAGAT GTGTACCGCATTTTGTTGGAAGAGGGTGTGGAAATCGGTGTGGCGACGATTTACCGTGTG CTGACCCAGTTTGAGCAGGCGGGCATTTTGCAACGCCATCATTTTGAAACGGGCAAGGCG GTTTATGAGTTGGACAAAGGCGACCACCATGACCACATCGTCTGCGTGAAGTGCGGCGAG GTAACGGAATTCCACAATCCCGAAATCGAAGCCCTGCAAGACAAAATCGCGGAAGAAAAC GGCTACCGCATCGTCGATCACGCGCTTTATATGTACGGCGTGTGCAGCGACTGTCAGGCC AAGGGCAAACGTTAA
Klonierungsstrategie
Mit PCR norB herausholen und in Biobrick vector klonieren. Als auch mit Fur.
Primerdesign
Stop-Codon sei rot Überhang sei durch ein Leerzeichen getrennt
| Primer | Sequenz | Tm | Schnittstellen | Besonderheiten | für Konstrukt |
|---|---|---|---|---|---|
| NorBf | GCAGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG CGGCAAACAGCAAGTACCAAAG | 71°C | E,N,X | Primer aus Paper + Überhang | NorB-Promotor |
| NorBr | CCGCTACTAGTA GAGGGATTGGTTAAGAACTTGGTG | 72°C | S,(N,P) | Primer aus Paper + Überhang | NorB-Promotor |
| Furf | CCGCTTCTAGAG ATGGAAAAATTCAACAATATTGCAC | 66°C | X | Primer aus Paper + Überhang | Fur N.meningitidis |
| Furr | AGCCTGCAGCGGCCGCTACTAGTA TTATTAACGTTTGCCCTTGGCCTG | 71°C | S, N, P | Primer aus Paper + doppelten Stopcodon + Überhang | Fur N.meningitidis |
| FurEcoRImutf | GAAGTGCGGCGAGGTAACGGA G TTCCACAATCCCGAAATCG | 71°C | keine | nach Stratagene Mutierungskitregeln | Fur N.meningitidis |
| FurEcoRImutr | CGATTTCGGGATTGTGGAA C TCCGTTACCTCGCCGCACTTC | 71°C | keine | nach Stratagene Mutierungskitregeln | Fur N.meningitidis |
Sonstiges
- Fur in pSB3C5, da low copy (B3) und terminator (C5)
- RhyB in pSB1C3, da high copy (B1) und ori kompatible mit pSB3C5
- Dann möglich beide Plasmide in delta Fur E.coli Stamm
Uebersicht doppelt negativ Schleife
| Metall | Kontakt hergestellt | Plasmid verfuegbar | Plasmid Sequenz bekannt | Klonierungsstrategie | Primerdesign |
|---|---|---|---|---|---|
| jedes was bei Bindung zum Repressor wird | ja | ja | nein, aber nicht nötig | PCR moeglich | ja |
Details
jedes was bei Bindung zum Repressor wird
Beschreibung des Sensors
- RyhB verhindert Translation von uof und was dahinter fusioniert ist (also ein Reporter)
- Promotor kann vor RyhB geschaltet werden
Problembeschreibung
Literatur
- http://www.nature.com/emboj/journal/v26/n4/abs/7601553a.html
Sequenzen
- RyhB: GCGATCAGGAAGACCCTCGCGGAGAACTGAAAGCACGACATTGCTTCCAGTATTACTTAGCCAGCCGGGTGCTGGCTTTT
- uof mit Startcodon und ersten 3 codons: GTGGTTTTCATTTAGGCGGATGGCAATTCTATAATGATACGCATTATCTCAAGAGCGCAAATTCTGTCACTTCTTCTAAT
GAAGTGAACCGCTTAGTAACAGGACAGATTCCGCATGACTGATAAC
Klonierungsstrategie
- Mittels PCR RyhB herausholen und reinklonieren
- Mittels PCR uof herausholen mit Promotor (IPTG induzierbar)
Primerdesign
Stop-Codon sei rot Überhang sei durch ein Leerzeichen getrennt
| Primer | Sequenz | Tm | Schnittstellen | Besonderheiten | für Konstrukt |
|---|---|---|---|---|---|
| RyhBf | GCAGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG GCGATCAGGAAGACCCTCGCGGAG | 85°C | E,N,X | direkt am Anfang von RhyB | RyhB und davor Metallpromotor |
| RyhBr | CCGCTACTAGTA AAAGCCAGCACCCGGCTGGCTAAG | 86°C | S (N,P) | direkt am Ende von RhyB | RyhB und davor Metallpromotor |
| uoff | GCAGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG GTGGTTTTCATTTAGGCGAG | 66°C | E,N,X | uof und erste 3 Codons von Fur, empfohlen 8. codon von Reporter daran fusionieren | uof dahinter Reporter, davor Promotor (z.B. IPTG-induzierbar) |
| uofr | CCGCTACTAGTA GTTATCAGTCATGCGGAATC | 66°C | S,(N,P) | uof und erste 3 Codons von Fur, empfohlen 8. codon von Reporter daran fusionieren | uof dahinter Reporter, davor Promotor (z.B. IPTG-induzierbar) |
Sonstiges
- Auch 2 Kompatible Plasmide nötig, wenn Regulator (Repressor) benötigt.
- Metallpromotor+RyhB+induzierbarer Promotor+ouf-Reporter auf einem Plasmid
Uebersicht Nickel NikR
| Metall | Kontakt hergestellt | Plasmid verfuegbar | Plasmid Sequenz bekannt | Klonierungsstrategie | Primerdesign |
|---|---|---|---|---|---|
| Ni2+ | ja | versprochen, noch nicht angekommen | nein | PCR moeglich, evtl 2.Operator per Primer-Dimer einbauen | alle bis auf einen |
Details
Ich wuerde hier die restlichen Informationen einfuegen, und vor allem eventuelle Probleme detailiert beschreiben.
Beschreibung des Sensors
NikR ist ein Repressor für das Nik-Operon, welcher in Anwesenheit von Ni2+ selbiges und an den Promotor des Nik-Operons bindet und dadurch die Transkription verhindert. Evtl. doppelt-negativ Schleife einbauen.
Problembeschreibung
Funktioniert nur anaerob, da FNR als Trankriptionsaktivator benötigt wird und FNR durch O2 inaktiviert wird. Evtl. anaerob kultivieren, eintrocknen und dann aerob verwendbar? Für quantitavie Analyse: Öl überschichten oder Folie drauf. Hohes Expressionsniveau ohne Nickel, aber nicht hundertprozentig dicht mit Nickel --> evtl 2. Operator. Plasmid wurde versprochen, aber noch nicht geschickt. Ansonsten PCR von gDNA E.coli K12 möglich.
Literatur
• Complex Transcriptional Control Links NikABCDE-Dependent Nickel Transport with Hydrogenase Expression in Escherichia coli (Rowe, Starnes, Chivers, 2005) "Link"
• Coordinating intracellular nickel-metal-site structure-function relationships and the NikR and RcnR repressors (Iwig, Chivers, 2010) "Abstract"habs leider bis jetzt nur ausgedruckt
• Nickel homeostasis in Escherichia coli – the rcnR-rcnA efflux pathway and its linkage to NikR function (Iwig, Lowe, Chivers, 2006) bald auf "Link"
• A microbial biosensor to predict bioavailable nickel in soil and its transfer to plants (Tibazarwa, Corbisier, Mench, Bossus, Solda, Mergeay, Wyns, van der Lelie, 2000) bald auf "Link"
• Regulation of High Affinity Nickel Uptake in Bacteria (Chivers, Sauer, 2000) http://team.rapidpages.com/
• http://genome-www.stanford.edu/vectordb/vector_descrip/COMPLETE/PACYC184.SEQ.html (Plasmid)
• http://genolist.pasteur.fr/Colibri/genome.cgi
Sequenzen
NikR operator site: TAATCAGTATGACGAATACTTAAAATCGTCATACTTATTT
Pnik: gtgtgcaatggatcgattcagttaactgatccgcccacccgactgcccatctattgatccagaacagg taatcagtatgacgaatacttaaaatcgtcatacttatttccgccatctattttaatccattggggttaccatgctctccacact ccgccgcactctatttgcgctgctggcttgtgcgtct
Pnik mit BB-Überhängen: (E,N,X) GCAGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGgtgtgcaatggatcgatt cagttaactgatccgcccacccgactgcccatctattgatccagaacaggtaatcagtatgacgaatacttaaaatcgtca tacttatttccgccatctattttaatccattggggttaccatgctctccacactccgccgcactctatttgcg ctgctggcttgtgcgtctTACTAGTAGCGG (S)
NikR (nicht relevant)
NikA (nicht relevant)
Klonierungsstrategie
Pnik mit den Primern Pnikf und Pnikr aus Plasmid/gDNA per PCR herausholen, mit E+S vor Reportergen klonieren.
Primerdesign
Stop-Codon sei rot Überhang sei durch ein Leerzeichen getrennt
| Primer | Sequenz | Tm | Schnittstellen | Besonderheiten | für Konstrukt |
|---|---|---|---|---|---|
| pnikA-E,N,X-fwd | GCAGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG TTAAGCCTTGCGATCTGCACC | 55°C | E,N,X | ca.200nt upstream von nikA | Pnik |
| pnikA-S-rev | CCGCTACTAGTA GACGATAAAAGACGCACAAGCC | 55°C | S | bei ca. 50nt von nikA | Pnik |
Uebersicht Nickel RcnR
| Metall | Kontakt hergestellt | Plasmid verfuegbar | Plasmid Sequenz bekannt | Klonierungsstrategie | Primerdesign |
|---|---|---|---|---|---|
| Ni2+ | ja (Chivers) | versprochen, aber noch nicht angekommen | nein | PCR moeglich | ja |
====Sonstiges
Details
Ich wuerde hier die restlichen Informationen einfuegen, und vor allem eventuelle Probleme detailiert beschreiben.
Beschreibung des Sensors
RcnR ist ein Repressor, welcher Ni2+ bindet und sich dann vom Operator löst, sodass nikA transkribiert werden kann.
Problembeschreibung
Wird auch von Co2+ induziert (aber nicht so stark); nicht so starker output.
Literatur
- Nickel homeostasis in Escherichia coli – the rcnR-rcnA efflux pathway and its linkage to NikR function (Iwig, Rowe, Chivers, 2006) "Link"
- 2010 folgt
Sequenzen
RcnR: nicht relevant
RcnA: nicht relevant
RcnR-Operator: tactggggggtagta und tactgggggggagta
PrcnA: mit BB-Überhängen: (E,N,X) GCAGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGacggattgtatgagacatggcaacacctggttaacaagaatatgaaaaatcatag cactattaatctactggggggtagtatcaggtactgggggggagtagaatcagattgccgaattaatactaagaattatt atcatgaccgaatttacaactcttcttcagcaaggaaacgcctggttcttcatccccagcgccatcttacttggtgcgTA CTAGTAGCGG (S)
Klonierungsstrategie
PCR von PrcnA vom Plasmid oder gDNA; einbringen vor Reportergen mit E+S.
Primerdesign
Stop-Codon sei rot Überhang sei durch ein Leerzeichen getrennt
| Primer | Sequenz | Tm | Schnittstellen | Besonderheiten | für Konstrukt |
|---|---|---|---|---|---|
| PrcnAfor | GCAGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG acggattgtatgagacatggca | 70°C | E,N,X | ca. 200nt vor rcnA | PrcnA |
| PrcnArev | CCGCTACTAGTA cgcaccaagtaagatggcg | 70°C | S | bis nt 75 von rcnA | PrcnA |
Sonstiges
Übersicht Blei
Bitte vervollstaendigt die Tabelle.
| Metall | Kontakt hergestellt | Plasmid verfuegbar | Plasmid Sequenz bekannt | Klonierungsstrategie | Primerdesign |
|---|---|---|---|---|---|
| Pb2+ | Antwortet noch nicht, späte Kontaktaufnahme | Abhängig von Antwort | nein | PCR möglich | steht |
Details
Pb2+
Beschreibung des Sensors
- Am praktischsten ist das pbr-Operon auf pMOL30 (links):
Problembeschreibung
- Die gleichen Probleme wie bei den anderen Resistenzgenen aus CH34 : S2-Einstufung etc.
- Bzgl der Arbeitsgruppe: habe mich erst spät gemeldet, daher die Verzögerung. Warte bis Anfang nächster Woche,
- dann weiß man genaueres
Literatur
- Die Abbildung aus der Beschreibung stammt aus "Lead(II) resistance in Cupriavidus metallidurans (2009)" (unter diesem Namen ist es auf dem Server gespeichert).
Sequenzen
- Die Sequenz des natuerlichen Plasmids (pMOL30),von welchem pbr urspruenglich kloniert wurde:
- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/291464753?report=fasta
- Hier der Regulator pbrR :
- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4036384
- Und pbrA:
- http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4036385
Klonierungsstrategie
-
Primerdesign
Primer pbR
- PbrR-M,R-fwd:Tm=71°C GCAGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG AAGAAGGAGATATACC ATGAATATCCAGATCGGCGAG Freiburg XmaI, mit RBS
- PbrR-S,A-rev: Tm=72°C AGCCTGCAGCGGCCGCTACTAGTA TTA CTAGTCGCTTGGATGGGCG Freiburg AgeI,SpeI
- pbrRT-S,A-rev: Tm=54°C agtcactagtattaaccgg tta TTACACCTGGGTAGATGGCC Freiburg AgeI,SpeI
- pbrRMut-fwd: tm=71°C tcgtgcgggattctc cagggactgtcggactgc
- pbrRMut-rev: tm= 72°C tccgacagtccctgg agaatcccgcacgattgggc
- Primer PpbrA
- ppbrA-E,N,X-fwd:Tm=62°C AGCCTGCAGCGGCCGCTACTAGTA GGTTGCGCGTCGCAACGGAAGC
- ppbrA-S-rev:Tm=60°C GCAGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG CATGCGGTGCGCTTGGCAAGC
- Primer gecheckt (auch Mut)
- In silico-PCR für alle gemacht
- Schnittstellen gecheckt
- pbrR mit RBS
Sind die Rohdaten, bringe die nochmal in ein besseres Format
