Team:LMU-Munich/intern/Status

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Contents

Planung

Metall PCR P done PrimerI Laenge TM PrimerII Laenge TM PCR Produkt Groesse Restriktions verdau R done Gelextraktion G done Ligation mit Vektor L done richtige Sequenz Naechster Schritt
Nickel pnikA "+" pnikA-E,N,X-fwd 46 55 pnikA-S-rev 34 55 248+37 E+S "+" to do "-" to do "-" "-" Reporter
Nickel prcnA "+" prcnA-E,N,X-fwd 47 70 prcnA-S-rev 31 70 213+37 E+S "+" to do "-" to do "-" "-" Reporter

Aktueller Stand der Recherche

Metall Kontakt hergestellt Plasmid verfuegbar Plasmid Sequenz bekannt Klonierungsstrategie Primerdesign
Zn?+ Ja Ja Noch nicht PCR moeglich nein
Hg Ja Ja Noch nicht PCR moeglich nein
Cd Ja Ja Noch nicht PCR moeglich nein
As3+ Antwortet nicht, aktuelle Kontaktdaten Nicht benötigt nein PCR moeglich nein
CrO42- / Cr2O72- Ja Ja nein PCR moeglich nein
Fe2+ (Mn2+) Ja Fur ja, norB leider verloren nein, aber nicht nötig PCR moeglich Ja
jedes was bei Bindung zum Repressor wird ja ja nein, aber nicht nötig PCR moeglich ja
Ni2+ NikR ja von E.coliK12 gDNA nein PCR moeglich ja
Ni2+ RcnR ja (Chivers) von E.coliK12 gDNA nein PCR moeglich ja
Pb2+ Antwortet noch nicht, späte Kontaktaufnahme Abhängig von Antwort nein PCR möglich steht

Übersicht Zn; Hg; Cd

Metall Kontakt hergestellt Plasmid verfuegbar Plasmid Sequenz bekannt Klonierungsstrategie Primerdesign
Zn?+ Ja Ja Noch nicht PCR moeglich nein
Hg Ja Ja Noch nicht PCR moeglich nein
Cd Ja Ja Noch nicht PCR moeglich nein


Bitte, bitte, bitte, editiere mich!!!!!!!!!!!!!!!!

Übersicht Arsen/Antimon

Bitte vervollstaendigt die Tabelle.


Metall Kontakt hergestellt Plasmid verfuegbar Plasmid Sequenz bekannt Klonierungsstrategie Primerdesign
As3+ Antwortet nicht, aktuelle Kontaktdaten Nicht benötigt nein PCR moeglich nein


Details

evtl Probleme wegen Patent.

As3+

Beschreibung des Sensors

Uebersicht Chrom

Bitte vervollstaendigt die Tabelle.


Metall Kontakt hergestellt Plasmid verfuegbar Plasmid Sequenz bekannt Klonierungsstrategie Primerdesign
CrO42- / Cr2O72- Ja Ja nein PCR moeglich nein


Details

CrO42- / Cr2O72-

Beschreibung des Sensors
1998 wurde ein Plasmid (pEBZ141) entwickelt, welches eine Fusion ist von dem Chrom-Resistenz Gen chr und einer Luciferase ist.
chr kodiert unter anderem fuer einen Chromtransporter.
Der Sensor ist sehr selektiv (effektiv reagiert er nur auf Chromat und Dichromat) und scheint zuverlaessig zu arbeiten.
Fuer eine hohe Effizienz wird ein bestimmter Stamm von CH34 benoetigt (AE104), welcher kein naturliches Plasmid besitzt.
Problembeschreibung
Ich habe den Kontakt mit der Gruppe hergestellt. Prinzipiell koennen wir das Plasmid haben, wir brauchen jedoch die Zustimmung von Bayer. Anfrage wurde versendet (Mittwoch), bisher noch keine Antwort.
Ein weiteres Problem koennte der CH34 Stamm sein. Angeblich wird eine Einstufung nach S2 diskutiert und der Prof. kann die entsprechenden Staemme deswegeb nicht verschicken. Wir haben ein S2 Labor zur Verfuegung. Noch keine Ruecksprache gehalten. Warte auf Bayer.
Literatur
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=pEBZ141
Sequenzen
Die Sequenz des natuerlichen Plasmids (pMOL28) von welchem chr urspruenglich kloniert wurde.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/291434858?report=fasta
chr liegt auf dem - Strang zwischen den Basenpaaren 49924 und 52146.
Klonierungsstrategie

Mittels PCR chrBA'::lux vom Plasmid klonieren und in Biobrick einfuegen. Ich habe nach der Sequenz von pEBZ141 noch nicht gefragt.

Primerdesign

Stop-Codon sei rot Überhang sei durch ein Leerzeichen getrennt

Primer Sequenz Tm Schnittstellen Besonderheiten für Konstrukt
ChrBAfor AgtcgccggcAAGAAGGAGATATACC ATGAACGCTCTCCCATCCTC 54°C NgoMIV liegt auf Plasmid ChrBA
ChrBArev agtcactagtattaaccgg tta TCAGTGATGCAACAACGGATAGG 56°C AgeI, SpeI liegt auf Plasmid ChrBA
Name3f AAA 60°C E,N,X Mutagenierung NikR
Name4r AAA 60°C S,(N,P) Mutagenierung NikR
Sonstiges

Uebersicht Eisen

Metall Kontakt hergestellt Plasmid verfuegbar Plasmid Sequenz bekannt Klonierungsstrategie Primerdesign
Fe2+ (Mn2+) Ja Fur ja, norB leider verloren nein, aber nicht nötig PCR moeglich Ja


Details

Fe2+ (Mn2+)

Beschreibung des Sensors
norB als Promotor. Wobei Fur als Aktivator bei Eisenbindung wirkt
eventuel N. meningitidis Fur benötigt, auch bereits angefragt (bereits angekommen)
dabei ein Fur deletierten E.coli Stamm nötig, auch bereits angefragt (bereits angekommen)
Problembeschreibung
N.meningitidis muss benutzt werden um norB herauszuholen (Pettenkofer anfragen ...)
Literatur
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15130126
Sequenzen
norB:CGGCAAATCAGGCAAAGGCAGGGTAGTTGCCGACTAAAGAATAATGATAGTTATTATCATATATGTATTTGTTTTATATG

TGAGTTTCTTTGAACAAATGTTTATTTGCGCGGTAAACCGTGCTACAATCTTTAACATTCATATTTTGTGAATTTTAATC CACTATATATTAAAAGGAGCTCTCAAAATG

Fur N.meningitidis:ATGGAAAAATTCAACAATATTGCACAACTGAAAGACAGCGGTCTGAAGGTTACCGGCCCG

CGTTTGAAGATTTTGGATTTGTTCGAGACGCATGCGGAAGAGCATTTGAGTGCGGAAGAT GTGTACCGCATTTTGTTGGAAGAGGGTGTGGAAATCGGTGTGGCGACGATTTACCGTGTG CTGACCCAGTTTGAGCAGGCGGGCATTTTGCAACGCCATCATTTTGAAACGGGCAAGGCG GTTTATGAGTTGGACAAAGGCGACCACCATGACCACATCGTCTGCGTGAAGTGCGGCGAG GTAACGGAATTCCACAATCCCGAAATCGAAGCCCTGCAAGACAAAATCGCGGAAGAAAAC GGCTACCGCATCGTCGATCACGCGCTTTATATGTACGGCGTGTGCAGCGACTGTCAGGCC AAGGGCAAACGTTAA

Klonierungsstrategie

Mit PCR norB herausholen und in Biobrick vector klonieren. Als auch mit Fur.

Primerdesign

Stop-Codon sei rot Überhang sei durch ein Leerzeichen getrennt

Primer Sequenz Tm Schnittstellen Besonderheiten für Konstrukt
NorBf GCAGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG CGGCAAACAGCAAGTACCAAAG 71°C E,N,X Primer aus Paper + Überhang NorB-Promotor
NorBr CCGCTACTAGTA GAGGGATTGGTTAAGAACTTGGTG 72°C S,(N,P) Primer aus Paper + Überhang NorB-Promotor
Furf CCGCTTCTAGAG AAGAAGGAGATATACC ATGGAAAAATTCAACAATATTGCAC 66°C X Primer aus Paper + RBS + Überhang Fur N.meningitidis
Furr AGCCTGCAGCGGCCGCTACTAGTA TTATTAACGTTTGCCCTTGGCCTG 71°C S, N, P Primer aus Paper + doppelten Stopcodon + Überhang Fur N.meningitidis
FurEcoRImutf GAAGTGCGGCGAGGTAACGGA G TTCCACAATCCCGAAATCG 71°C keine nach Stratagene Mutierungskitregeln Fur N.meningitidis
FurEcoRImutr CGATTTCGGGATTGTGGAA C TCCGTTACCTCGCCGCACTTC 71°C keine nach Stratagene Mutierungskitregeln Fur N.meningitidis
Sonstiges
Fur in pSB3C5, da low copy (B3) und terminator (C5)
RhyB in pSB1C3, da high copy (B1) und ori kompatible mit pSB3C5
Dann möglich beide Plasmide in delta Fur E.coli Stamm

Uebersicht doppelt negativ Schleife

Metall Kontakt hergestellt Plasmid verfuegbar Plasmid Sequenz bekannt Klonierungsstrategie Primerdesign
jedes was bei Bindung zum Repressor wird ja ja nein, aber nicht nötig PCR moeglich ja


Details

jedes was bei Bindung zum Repressor wird

Beschreibung des Sensors
RyhB verhindert Translation von uof und was dahinter fusioniert ist (also ein Reporter)
Promotor kann vor RyhB geschaltet werden
Problembeschreibung
Literatur
http://www.nature.com/emboj/journal/v26/n4/abs/7601553a.html
Sequenzen
RyhB: GCGATCAGGAAGACCCTCGCGGAGAACTGAAAGCACGACATTGCTTCCAGTATTACTTAGCCAGCCGGGTGCTGGCTTTT
uof mit Startcodon und ersten 3 codons: GTGGTTTTCATTTAGGCGGATGGCAATTCTATAATGATACGCATTATCTCAAGAGCGCAAATTCTGTCACTTCTTCTAAT

GAAGTGAACCGCTTAGTAACAGGACAGATTCCGCATGACTGATAAC

Klonierungsstrategie
Mittels PCR RyhB herausholen und reinklonieren
Mittels PCR uof herausholen mit Promotor (IPTG induzierbar)
Primerdesign

Stop-Codon sei rot Überhang sei durch ein Leerzeichen getrennt

Primer Sequenz Tm Schnittstellen Besonderheiten für Konstrukt
RyhBf GCAGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG GCGATCAGGAAGACCCTCGCGGAG 85°C E,N,X direkt am Anfang von RhyB RyhB und davor Metallpromotor
RyhBr CCGCTACTAGTA AAAGCCAGCACCCGGCTGGCTAAG 86°C S (N,P) direkt am Ende von RhyB RyhB und davor Metallpromotor
uoff GCAGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG GTGGTTTTCATTTAGGCGAG 66°C E,N,X uof und erste 3 Codons von Fur, empfohlen 8. codon von Reporter daran fusionieren uof dahinter Reporter, davor Promotor (z.B. IPTG-induzierbar)
uofr CCGCTACTAGTA GTTATCAGTCATGCGGAATC 66°C S,(N,P) uof und erste 3 Codons von Fur, empfohlen 8. codon von Reporter daran fusionieren uof dahinter Reporter, davor Promotor (z.B. IPTG-induzierbar)
Sonstiges
Auch 2 Kompatible Plasmide nötig, wenn Regulator (Repressor) benötigt.
Metallpromotor+RyhB+induzierbarer Promotor+ouf-Reporter auf einem Plasmid

Uebersicht Nickel NikR

Metall Kontakt hergestellt Plasmid verfuegbar Plasmid Sequenz bekannt Klonierungsstrategie Primerdesign
Ni2+ ja versprochen, noch nicht angekommen nein PCR moeglich, evtl 2.Operator per Primer-Dimer einbauen alle bis auf einen


Details

Ich wuerde hier die restlichen Informationen einfuegen, und vor allem eventuelle Probleme detailiert beschreiben.

Beschreibung des Sensors

NikR ist ein Repressor für das Nik-Operon, welcher in Anwesenheit von Ni2+ selbiges und an den Promotor des Nik-Operons bindet und dadurch die Transkription verhindert. Evtl. doppelt-negativ Schleife einbauen.

Problembeschreibung

Funktioniert nur anaerob, da FNR als Trankriptionsaktivator benötigt wird und FNR durch O2 inaktiviert wird. Evtl. anaerob kultivieren, eintrocknen und dann aerob verwendbar? Für quantitavie Analyse: Öl überschichten oder Folie drauf. Hohes Expressionsniveau ohne Nickel, aber nicht hundertprozentig dicht mit Nickel --> evtl 2. Operator. Plasmid wurde versprochen, aber noch nicht geschickt. Ansonsten PCR von gDNA E.coli K12 möglich.

Literatur

• Complex Transcriptional Control Links NikABCDE-Dependent Nickel Transport with Hydrogenase Expression in Escherichia coli (Rowe, Starnes, Chivers, 2005) "Link"

• Coordinating intracellular nickel-metal-site structure-function relationships and the NikR and RcnR repressors (Iwig, Chivers, 2010) "Abstract"habs leider bis jetzt nur ausgedruckt

• Nickel homeostasis in Escherichia coli – the rcnR-rcnA efflux pathway and its linkage to NikR function (Iwig, Lowe, Chivers, 2006) bald auf "Link"

• A microbial biosensor to predict bioavailable nickel in soil and its transfer to plants (Tibazarwa, Corbisier, Mench, Bossus, Solda, Mergeay, Wyns, van der Lelie, 2000) bald auf "Link"

• Regulation of High Affinity Nickel Uptake in Bacteria (Chivers, Sauer, 2000) http://team.rapidpages.com/

• http://genome-www.stanford.edu/vectordb/vector_descrip/COMPLETE/PACYC184.SEQ.html (Plasmid)

• http://genolist.pasteur.fr/Colibri/genome.cgi

Sequenzen

NikR operator site: TAATCAGTATGACGAATACTTAAAATCGTCATACTTATTT

Pnik: gtgtgcaatggatcgattcagttaactgatccgcccacccgactgcccatctattgatccagaacagg taatcagtatgacgaatacttaaaatcgtcatacttatttccgccatctattttaatccattggggttaccatgctctccacact ccgccgcactctatttgcgctgctggcttgtgcgtct

Pnik mit BB-Überhängen: (E,N,X) GCAGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGgtgtgcaatggatcgatt cagttaactgatccgcccacccgactgcccatctattgatccagaacaggtaatcagtatgacgaatacttaaaatcgtca tacttatttccgccatctattttaatccattggggttaccatgctctccacactccgccgcactctatttgcg ctgctggcttgtgcgtctTACTAGTAGCGG (S)

NikR (nicht relevant)

NikA (nicht relevant)

Klonierungsstrategie

Pnik mit den Primern Pnikf und Pnikr aus Plasmid/gDNA per PCR herausholen, mit E+S vor Reportergen klonieren.

Primerdesign

Stop-Codon sei rot Überhang sei durch ein Leerzeichen getrennt

Primer Sequenz Tm Schnittstellen Besonderheiten für Konstrukt
pnikA-E,N,X-fwd GCAGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG TTAAGCCTTGCGATCTGCACC 55°C E,N,X ca.200nt upstream von nikA Pnik
pnikA-S-rev CCGCTACTAGTA GACGATAAAAGACGCACAAGCC 55°C S bei ca. 50nt von nikA Pnik

Uebersicht Nickel RcnR

Metall Kontakt hergestellt Plasmid verfuegbar Plasmid Sequenz bekannt Klonierungsstrategie Primerdesign
Ni2+ ja (Chivers) versprochen, aber noch nicht angekommen nein PCR moeglich ja

====Sonstiges

Details

Ich wuerde hier die restlichen Informationen einfuegen, und vor allem eventuelle Probleme detailiert beschreiben.

Beschreibung des Sensors

RcnR ist ein Repressor, welcher Ni2+ bindet und sich dann vom Operator löst, sodass nikA transkribiert werden kann.

Problembeschreibung

Wird auch von Co2+ induziert (aber nicht so stark); nicht so starker output.

Literatur
  • Nickel homeostasis in Escherichia coli – the rcnR-rcnA efflux pathway and its linkage to NikR function (Iwig, Rowe, Chivers, 2006) "Link"
  • 2010 folgt
Sequenzen

RcnR: nicht relevant

RcnA: nicht relevant

RcnR-Operator: tactggggggtagta und tactgggggggagta

PrcnA: mit BB-Überhängen: (E,N,X) GCAGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGacggattgtatgagacatggcaacacctggttaacaagaatatgaaaaatcatag cactattaatctactggggggtagtatcaggtactgggggggagtagaatcagattgccgaattaatactaagaattatt atcatgaccgaatttacaactcttcttcagcaaggaaacgcctggttcttcatccccagcgccatcttacttggtgcgTA CTAGTAGCGG (S)


Klonierungsstrategie

PCR von PrcnA vom Plasmid oder gDNA; einbringen vor Reportergen mit E+S.

Primerdesign

Stop-Codon sei rot Überhang sei durch ein Leerzeichen getrennt

Primer Sequenz Tm Schnittstellen Besonderheiten für Konstrukt
prcnA-E,N,X-fwd GCAGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG acggattgtatgagacatggca 70°C E,N,X ca. 200nt vor rcnA PrcnA
prcnA-S-rev CCGCTACTAGTA cgcaccaagtaagatggcg 70°C S bis nt 75 von rcnA PrcnA
Sonstiges

Übersicht Blei

Bitte vervollstaendigt die Tabelle.


Metall Kontakt hergestellt Plasmid verfuegbar Plasmid Sequenz bekannt Klonierungsstrategie Primerdesign
Pb2+ Antwortet noch nicht, späte Kontaktaufnahme Abhängig von Antwort nein PCR möglich steht


Details

Pb2+

Beschreibung des Sensors
Am praktischsten ist das pbr-Operon auf pMOL30 (links):
Lmu2011 operon pbr.jpg
Problembeschreibung
Die gleichen Probleme wie bei den anderen Resistenzgenen aus CH34 : S2-Einstufung etc.
Bzgl der Arbeitsgruppe: habe mich erst spät gemeldet, daher die Verzögerung. Warte bis Anfang nächster Woche,
dann weiß man genaueres
Literatur
Die Abbildung aus der Beschreibung stammt aus "Lead(II) resistance in Cupriavidus metallidurans (2009)" (unter diesem Namen ist es auf dem Server gespeichert).
Sequenzen
Die Sequenz des natuerlichen Plasmids (pMOL30),von welchem pbr urspruenglich kloniert wurde:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/291464753?report=fasta
Hier der Regulator pbrR :
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4036384
Und pbrA:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4036385
Klonierungsstrategie

-

Primerdesign

Primer pbR

PbrR-M,R-fwd:Tm=71°C GCAGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG AAGAAGGAGATATACC ATGAATATCCAGATCGGCGAG Freiburg XmaI, mit RBS
PbrR-S,A-rev: Tm=72°C AGCCTGCAGCGGCCGCTACTAGTA TTA CTAGTCGCTTGGATGGGCG Freiburg AgeI,SpeI
pbrRT-S,A-rev: Tm=54°C agtcactagtattaaccgg tta TTACACCTGGGTAGATGGCC Freiburg AgeI,SpeI
pbrRMut-fwd: tm=71°C tcgtgcgggattctc cagggactgtcggactgc
pbrRMut-rev: tm= 72°C tccgacagtccctgg agaatcccgcacgattgggc
Primer PpbrA
ppbrA-E,N,X-fwd:Tm=62°C AGCCTGCAGCGGCCGCTACTAGTA GGTTGCGCGTCGCAACGGAAGC
ppbrA-S-rev:Tm=60°C GCAGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG CATGCGGTGCGCTTGGCAAGC


Primer gecheckt (auch Mut)
In silico-PCR für alle gemacht
Schnittstellen gecheckt
pbrR mit RBS

Sind die Rohdaten, bringe die nochmal in ein besseres Format

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