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Contents 1 Lab Notebook 2 Lab Protocols 2.1 PCR (PrimeSTAR® HS DNA Polymerase) 2.2 Electrophoresis 2.3 Ethanol precipitation 2.4 Plasmid Extraction 2.5 Digestion 2.6 Ligation 2.7 Transformation 2.8 Colony PCR(Takara EX® Taq) 2.9 Making Medium for Culture 2.10 Making Gel for Electrophoresis

Lab Notebook

Lab Protocols

PCR (PrimeSTAR® HS DNA Polymerase)

• Ice
• Micro pipette**Thermal cycler
• PCR Tube
• Micro Tube
• DW
• 5× PCR Buffer
• dNTP　(2.5mM)
• Primer(Forward & Reverse)　 (20µM)
• Template DNA
• PrimeSTAR® HS DNA Polymerase　(2.5U/μl)

1. 以下の組成で、DW→Buffer→dNTP→primer→Template DNA→polymeraseの順に混ぜていく。反応液の調製は氷上で行う。Template DNAが液体の場合、その分DWの量を減らす。
2. 良く撹拌(×ボルテックス)した後、氷上のPCR Tubeに分注する（50µlずつ）
3. Thermal cyclerにセットし、RUNする。
   • 98℃・・・10sec
   • 55℃・・・5 or 15sec
   • 72℃・・・1min×1kbpごと 30cycle
4. 反応終了後、電気泳動にて結果を観察 or 4℃で保存。

Electrophoresis

• Gel
• 泳動槽
• Parafilm
• Micro pipette
• TAE Buffer
• 6× Loading Buffer
• DW
• 5× PCR Buffer

1. 泳動槽にゲルをセットし、TAE Bufferをゲルが浸るまで入れる。
   • Loading Buffer・・・1µl
   • DNA solution・・・5µl
   • DW・・・5µlをParafilmの上で、ピペッティングにより混ぜ、ゲルのウェルに入れる。
2. 電流を流し、泳動する。（100V：通常のとき、50V：ゆっくりと丁寧に流したいとき）
3. 紫外光をあてバンドを確認する。

Ethanol precipitation

• Centrifuge
• Micro Tube
• Micro pipette
• Aspirator
• 99.5％Ethanol
• 3.0M Sodium acetate (pH5.2)
• TE Buffer

1. 核酸（DNAまたはRNA）溶液に1/10量の3.0M Sodium acetateを加え混合する。
2. 溶液100µlあたり1µl（溶液が400µl以下の時は4µl）のGenとるくんエタ沈キャリアーを加え混合する。
3. 2.5倍量のEthanolを加え十分混合し、遠心(12000rpm,15min,4℃,)する。
4. 遠心後、上清を除き、70%Ethanolを加え(3の総量と同量)混合し、遠心(12000rpm,5min,4℃,)する。＝洗い
5. 遠心後、上清を除き、乾燥する。
6. 適当量のDWまたは TE Bufferを加え、沈殿を再溶解する。

Plasmid Extraction

• Ice
• Micro Tube
• Micro pipette
• Centrifuge
• 50ｍM glucose ; 10mM EDTA ; 25ml Tris-HCl (pH 8.0)
• 5N NaOH
• 10％ SDS
• 3M Potassium Acetate (pH 4.8)

1. 菌の前培養液を遠心(12000rpm,5min)し、上清を捨てる。
2. 沈殿を50ｍM glucose; 10mM EDTA; 25mM Tris-HCl (pH 8.0) 100μlで再懸濁する。
3. 0.2N NaOH; 1％ SDS（用時調整）200μlを加え混合し、氷上で5minインキュベートする。
4. 3M Potassium Acetate (pH 4.8) 150μl を加えよく混合し、氷上5minインキュベートする。
5. 遠心(12000rpm,5min)し、遠心後上清を回収する。

Digestion

• Micro Tube
• Micro pipette
• Heat Block　or Water bus
• Digest Enzyme
• 10×Buffer　
• DW

1. Tubeに加え、混合する.
2. 37℃でインキュベートする（2～16ｈ）

Ligation

• Micro Tube
• Micro pipette
• Heat Block
• T4 Ligase
• 10× Buffer　
• DW

1. Tubeに加え、混合する.
2. 16℃でインキュベートする（30min～1ｈ）

Transformation

• Micro pipette
• Heat Block　or Water bus
• ECOS™ Competent E. coli
• Plate (Antibiotic)
• Spreader

1. 氷上でコンピテントセルを融解する。
2. 4℃または氷上で冷却したプラスミド溶液またはライゲーション溶液(コンピテントセルの5％以下)を加える。
3. 直ちにボルテックスで 1秒間撹拌する。
4. 氷上で 5minインキュベートする。
5. 直ちに 42℃で 45 secインキュベートする。
6. 氷上で 2minインキュベートする。
7. あらかじめ37℃で保温しておいた Hi-Competence Broth またはSOC培地を、コンピテントセルの 4倍量程度加え、37℃で30minインキュベートする（この作業はアンピシリン使用時省く）
8. 100 µl～全量を LB Plateに移し均一に塗布する。
9. 37℃で 12～16hインキュベートする.

Colony PCR(Takara EX® Taq)

• Plate
• Ice
• Micro pipette
• Thermal cycler
• Burner
• 70％EtOH
• Toothpick (爪楊枝)
• PCRTube
• Micro Tube
• Spreader
• DW
• 10× PCR Buffer
• dNTP (2.5mM)
• primer(Forward & Reverse)　(20µM)
• Taq Polymerase

1. 培養し、プレートに形成されたコロニーに番号を振る。（数が多い際は、他のコロニーと距離が離れている、コロニーが大きい等の基準から48のコロニーをピックアップする）
2. 何も生やしていない抗生物質入りの培地の裏に、１で振った番号を等間隔に書きこむ。（このプレートをマスタープレートという）
3. コロニーの数分、以下の組成でDW→Buffer→dNTP→primer→polymeraseの順に混ぜていく。調製は氷上で行う。
4. 良く撹拌(×ボルテックス)した後、氷上のPCRTubeに分注する（25µlずつ
5. ガスバーナーの火下で、ⅰ)爪楊枝で番号を振ったコロニー(番号は①から)をつつき、ⅱ)PCRTubeに突っ込み、ⅲ)マスタープレートの対応した番号の場所に刺す。（この3つ作業は同じ爪楊枝で行う）
6. 5の作業をコロニーの数繰り返す。
7. すべてのコロニー分のPCRTubeを作り終えたらThermal cyclerにセットし、RUNする。
8. 反応終了後、電気泳動にて結果を観察 or 4℃で保存。

Making Medium for Culture

• Erlenmeyer flask
• Graduated cylinder
• Test Tube or Plate
• Autoclave
• Stirrer
• Electronic balance
• Burner or Clean bench
• Yeast Extract
• Peptone
• NaCl
• Antibiotic
• Agar

1. 電子天秤で目的培地の材料の量を測りとる。
2. 測り取った試薬にDWを目的量の9割程度加え、よく撹拌し溶解する。
3. DWで目的量までメスアップする（メスシリンダーを使う必要なし)
4. 試験管に10mlずつ分注し、121℃で15minオートクレーブにかける。
5. オートクレーブ後、抗生物質を入れる場合、培地を50～60℃に冷ましてから、無菌条件(バーナーの火下約30cm以内or　Clean bench内)で指定濃度になるように加える。
6. 無菌状態(バーナーの火下約30cm以内or　Clean bench内)で培地をプレートに分注し、冷まして固まらせる。
7. 無菌条件下で蓋をあけ、十分に乾燥させた後に4℃で保存する。

Making Gel for Electrophoresis

• Erlenmeyer flask
• Graduated cylinder
• Type of gel
• Microwave oven
• Electronic balance
• Agarose
• TAE Buffer
• EtBr Solution

1. TAE Bufferに任意の濃度（0.8～1.5％）になるようにAgaroseを加え、混ぜる。
2. レンジで加熱し、Agaroseを完全に溶解させる。
3. 50～60℃に冷まし、終濃度5µg/mlになるようにEtBr溶液を加える。
4. 型に流し込み、コームを刺し、固める。小さいウェル（10µl用）はPCRなどの確認用、大きいウェル（20µl用）はDNAのゲル抽出用（目的のバンドの分離用）である。
5. コームを抜き、使用 or 保存する。