Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNoteJ/DIAP2-MALTJ8

８月８日

Member

松浪、横井川

API2-MALT1、DIAP2について以下のプライマーを用いて、以下の条件でPCRを行った。

API2-MALT1

F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT

Tm値　57.8°C

R　primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA

Tm値　56.5°C

増幅サイズ　　約3131 bp

DIAP2

F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT

Tm値　69°C

R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA

Tm値　66.4°C

増幅サイズ　　約1514 bp

1.API2-MALT1

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 51.5°C 30sec Extension 72°C 3min20sec +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

2.DIAP2

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 56.9°C 30sec Extension 72°C 1min40sec +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

８月９日

Member

松浪、横井川

1.PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。

2.pUAST溶液のトランスフォーメーションを行った。

Results

1.泳動後の写真

1レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；DIAP2

2つとも予想される位置にバンドが確認されなかった。

2.コロニーの生育がみられた。

８月１０日

Member

松浪

1.API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でPCRを行った。

2.pUASTのプレカルチャー

Results

2.全てのサンプルに大腸菌の増殖がみられた。

８月１１日

Member

松浪

pUAST flag vectorのアルカリミニプレップをした後、プラスミドの確認をするため、電気泳動を行った。

Results

泳動後の写真

左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～9レーン；pUAST、10レーン；flag、11レーン；API2-MALT1、12レーン；DIAP2

pUASTは予想される位置にバンドが確認されたが、API2-MALT1、DIAP2は確認されなかった。

８月１２日

Member

松浪、横井川

1.pUAST flag vectorのアルカリミディプレップをした後、DNA濃度測定を行った。

2.プラスミドの確認をするため、電気泳動を行った。

Results

1.サンプル1、2の吸光度を測定した結果を以下に示す（表1）。

表1、サンプル1、2の吸光度の値

サンプル1

0.189

0.208

0.192

0.190

0.191

平均は0.194であった。

これより、サンプル1のDNA濃度は0.970 µg/µlであった。

サンプル2

0.282

0.276

0.278

0.269

0.269

平均は0.275でった。

これより、サンプル2のDNA濃度は1.37 µg/µlであった。

2.:泳動後の写真

左がマーカー(1kb)、右から順にサンプル1、サンプル2、flagである。

予想される位置にバンドが見られた。

８月１５日

Member

松浪、横井川

API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。

API2-MALT1

Anneling

58.9°C

DIAP2

Anneling

53°C

PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。

Results

泳動後の写真

左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；DIAP2

API2-MALT1は予想される位置にバンドが確認されず、DIAP2は複数本のバンドが見られた。

８月１６日

Member

松浪

API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。

API2-MALT1

Anneling

53°C

DIAP2

Anneling

58.9°C

PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。

Results

泳動後の写真

左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2
3レーン目のAPI2-MALT1は2 Kbpと3 Kbpにバンドが見られた。DIAP2はプライマーの特異性を高めたが、期待される位置にバンドはでなかった。

８月１７日

Member

松浪、横井川

API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。

API2-MALT1

Anneling

53.5°C

DIAP2

Anneling

50.5°C

PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。

Results

泳動後の写真

右から順に1レーン；マーカー、2・3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2
API2-MALT1は前回の条件でPCRしたが、前回より3 Kbpのバンドが薄くなった。DIAP2は予想された位置にバンドが見えなかった。

８月２３日

Member

松浪

API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。

API2-MALT1

Anneling

53°C

DIAP2

Anneling

50.5°C

PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。

Results

泳動後の写真

左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2、5レーン；DIAP2
API2-MALT1についてDNAポリメラーゼを変更したが、期待されるバンドは見られなかった。

８月２４日

Member

松浪

API2-MALT1について10、100倍希釈後、以下の条件でPCRを行った。

PCR条件 10 µM Primer F 0.4 µl 10 µM Primer R 0.4 µl Template DNA 1 µl 10 x Ex Taq Buffer 2 µl Takara Ex Taq 0.1 µl 2.0 mM dNTPs 2 µl ddH2O 14.1 µl   total 20 µl

Cycle条件 Pre-Denature 94°C 2min   Denature 94°C 30sec 37 Cycle Anneling 51.5°C 30sec Extension 72°C 3min20sec +Extension 72°C 10min   End 4°C keep

PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。

Results

泳動後の写真

左から順に2レーン；マーカー、3～6レーン；API2-MALT1（10倍希釈）、8～11レーン；API2-MALT1（100倍希釈）
バンドは何も見られなかった。

８月２５日

Member

松浪

API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。

API2-MALT1

Anneling

51.5°C

DIAP2

Anneling

50.5°C

PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。

Results

泳動後の写真

左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；API2-MALT1、4・5レーン；DIAP2
API2-MALT1に関してバンドは見られなかった。DIAP2については予想される位置にバンドが見られた。

８月２９日

Member

武田、横井川

25日に確認したDIAP2をフェノールクロロホルム処理し、

pUAST-flag vectorとともに、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)

DIAP2

DIAP2 PCR産物 in ddH2O 44 µl 10 x H Buffer 5 µl XhoⅠ 1 µl   total 50 µl

pUAST-flag vector pUAST-flag vector(500 ng/µl) 10 µl ddH2O 34 µl 10 x H Buffer 5 µl XhoⅠ 1 µl   total 50 µl

37°Cで20時間静置した。

８月３０日

Member

武田、横井川

25日に確認したDIAP2をフェノールクロロホルム処理し、

pUAST-flag vectorとともに、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)

DIAP2 PCR産物 in ddH2O 44 µl 10 x M Buffer 5 µl XbaⅠ 1 µl   total 50 µl

pUAST-flag vector pUAST-flag vector(500 ng/µl) 10 μl ddH2O 34 µl 10 x H Buffer 5 µl XhoⅠ 1 µl   total 50 µl

37°Cで20時間静置した 。

８月３１日

Member

武田、横井川

[http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx QIAquick Gel Extraction Kit]を使用してゲルからDIAP2のDNAとpUAST-flag vectorを抽出した。

Results

ゲル切り出し後の写真

pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375 ng/µlであった。

DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。