Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNoteJ/DIAP2-MALTJ8

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<div id=NAKAMI>
<div id=NAKAMI>
{| style="color:#000080;background-color:transparent;" cellpadding="3" cellspacing="1" border="0" bordercolor="#0000FF" width="900px" align="center"
{| style="color:#000080;background-color:transparent;" cellpadding="3" cellspacing="1" border="0" bordercolor="#0000FF" width="900px" align="center"
-
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<br>
<br>
-
==''８月８日''==
+
==''８月９日''==
<b>Member</b>
<b>Member</b>
<br>
<br>
:松浪、横井川
:松浪、横井川
<br>
<br>
-
:1.PCR産物が増幅していることを確認するため、100 V 30minでアガロース電気泳動を行った。
+
:1.PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
:2.pUAST溶液のトランスフォーメーションを行った。
:2.pUAST溶液のトランスフォーメーションを行った。
<br>
<br>
Line 118: Line 118:
:松浪
:松浪
<br>
<br>
-
:1.API2-MALT1、DIAP2について、以下の条件でPCRを行った。
+
:1.API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でPCRを行った。
:2.pUASTのプレカルチャー
:2.pUASTのプレカルチャー
<br>
<br>
-
:1.API2-MALT1<br>
+
<b>Results</b>
 +
:2.全てのサンプルに大腸菌の増殖がみられた。
 +
<br>
 +
 
 +
==''８月１１日''==
 +
<b>Member</b>
 +
<br>
 +
:松浪
 +
<br>
 +
:pUAST flag vectorのアルカリミニプレップをした後、プラスミドの確認をするため、電気泳動を行った。
 +
<br>
 +
<b>Results</b>
 +
:泳動後の写真<BR>
 +
:<html><body>
 +
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/2/21/2011.08.11_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0">
 +
</body></html>
 +
<br>
 +
:左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～9レーン；pUAST、10レーン；flag、11レーン；API2-MALT1、12レーン；DIAP2<br>
 +
:pUASTは予想される位置にバンドが確認されたが、API2-MALT1、DIAP2は確認されなかった。
 +
<br>
 +
 
 +
==''８月１２日''==
 +
<b>Member</b>
 +
<br>
 +
:松浪、横井川
 +
<br>
 +
:1.pUAST flag vectorのアルカリミディプレップをした後、DNA濃度測定を行った。
 +
:2.プラスミドの確認をするため、電気泳動を行った。
 +
<br>
 +
<b>Results</b>
 +
:1.サンプル1、2の吸光度を測定した結果を以下に示す（表1）。
 +
<br>
 +
:表1、サンプル1、2の吸光度の値
 +
:サンプル1
 +
:<table border=1 width="500px">
 +
:<tr><td width="100px" align=rjght>0.189</td><td width="100px" align=rjght>0.208</td><td width="100px" align=rjght>0.192</td><td width="100px" align=rjght>0.190</td><td width="100px" align=rjght>0.191</td></tr>
 +
:</table>
 +
:平均は0.194であった。
 +
:これより、サンプル1のDNA濃度は0.970 µg/µlであった。<br>
 +
<br>
 +
:サンプル2
 +
:<table border=1 width="500px">
 +
:<tr><td width="100px" align=rjght>0.282</td><td width="100px" align=rjght>0.276</td><td width="100px" align=rjght>0.278</td><td width="100px" align=rjght>0.269</td><td width="100px" align=rjght>0.269</td></tr>
 +
:</table>
 +
:平均は0.275でった。
 +
:これより、サンプル2のDNA濃度は1.37 µg/µlであった。
 +
<br>
 +
2.:泳動後の写真<BR>
 +
:<html><body>
 +
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/3/30/2011.08.14_%E6%9D%BE%E6%B5%AA.JPG" width="250px" height="250px" border="0">
 +
</body></html>
 +
<br>
 +
:左がマーカー(1kb)、右から順にサンプル1、サンプル2、flagである。
 +
:予想される位置にバンドが見られた。
 +
<br>
 +
 
 +
==''８月１５日''==
 +
<b>Member</b>
 +
<br>
 +
:松浪、横井川
 +
<br>
 +
:API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
 +
 
 +
:API2-MALT1<br>
 +
:<table border=1 width="200px">
 +
:<tr><td width="100px" align=center>Anneling</td><td align=center>58.9°C</td></tr>
 +
:</table>
 +
 
 +
:DIAP2<br>
 +
:<table border=1 width="200px">
 +
:<tr><td width="100px" align=center>Anneling</td><td align=center>53°C</td></tr>
 +
:</table>
 +
 
 +
:PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
 +
<br>
 +
<b>Results</b>
 +
:泳動後の写真<BR>
 +
:<html><body>
 +
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/0/0c/2011.08.15_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0">
 +
</body></html>
 +
<br>
 +
:左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；DIAP2<br>
 +
:API2-MALT1は予想される位置にバンドが確認されず、DIAP2は複数本のバンドが見られた。
 +
<br>
 +
 
 +
==''８月１６日''==
 +
<b>Member</b>
 +
<br>
 +
:松浪
 +
<br>
 +
:API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
 +
 
 +
:API2-MALT1<br>
 +
:<table border=1 width="200px">
 +
:<tr><td width="100px" align=center>Anneling</td><td align=center>53°C</td></tr>
 +
:</table>
 +
 
 +
:DIAP2<br>
 +
:<table border=1 width="200px">
 +
:<tr><td width="100px" align=center>Anneling</td><td align=center>58.9°C</td></tr>
 +
:</table>
 +
 
 +
:PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
 +
<br>
 +
<b>Results</b>
 +
:泳動後の写真<BR>
 +
:<html><body>
 +
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/c/c3/2011.08.16_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0">
 +
</body></html>
 +
<br>
 +
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2<br>
 +
3レーン目のAPI2-MALT1は2 Kbpと3 Kbpにバンドが見られた。DIAP2はプライマーの特異性を高めたが、期待される位置にバンドはでなかった。
 +
<br>
 +
 
 +
==''８月１７日''==
 +
<b>Member</b>
 +
<br>
 +
:松浪、横井川
 +
<br>
 +
:API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
 +
 
 +
:API2-MALT1<br>
 +
:<table border=1 width="200px">
 +
:<tr><td width="100px" align=center>Anneling</td><td align=center>53.5°C</td></tr>
 +
:</table>
 +
 
 +
:DIAP2<br>
 +
:<table border=1 width="200px">
 +
:<tr><td width="100px" align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td></tr>
 +
:</table>
 +
 
 +
:PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
 +
<br>
 +
<b>Results</b>
 +
:泳動後の写真<BR>
 +
:<html><body>
 +
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/9/98/2011.08.17_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0">
 +
</body></html>
 +
<br>
 +
右から順に1レーン；マーカー、2・3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2<br>
 +
API2-MALT1は前回の条件でPCRしたが、前回より3 Kbpのバンドが薄くなった。DIAP2は予想された位置にバンドが見えなかった。
 +
<br>
 +
 
 +
==''８月２３日''==
 +
<b>Member</b>
 +
<br>
 +
:松浪
 +
<br>
 +
:API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
 +
 
 +
:API2-MALT1<br>
 +
:<table border=1 width="200px">
 +
:<tr><td width="100px" align=center>Anneling</td><td align=center>53°C</td></tr>
 +
:</table>
 +
 
 +
:DIAP2<br>
 +
:<table border=1 width="200px">
 +
:<tr><td width="100px" align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td></tr>
 +
:</table>
 +
 
 +
:PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
 +
<br>
 +
<b>Results</b>
 +
:泳動後の写真<BR>
 +
:<html><body>
 +
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/6/68/2011.08.23_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0">
 +
</body></html>
 +
<br>
 +
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2、5レーン；DIAP2<br>
 +
API2-MALT1についてDNAポリメラーゼを変更したが、期待されるバンドは見られなかった。
 +
<br>
 +
 
 +
==''８月２４日''==
 +
<b>Member</b>
 +
<br>
 +
:松浪
 +
<br>
 +
:API2-MALT1について10、100倍希釈後、以下の条件でPCRを行った。
 +
 
:<table border="0"><tr><td>
:<table border="0"><tr><td>
:<table border="0" width="150px">
:<table border="0" width="150px">
Line 141: Line 319:
:</table>
:</table>
:<table border=1 width="400px">
:<table border=1 width="400px">
-
:<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px" align=center>2min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+
:<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px" align=center>2min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
:<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
:<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
:<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
:<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
Line 150: Line 328:
:</td></tr>
:</td></tr>
:</table>
:</table>
 +
 +
:PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
<br>
<br>
 +
<b>Results</b>
 +
:泳動後の写真<BR>
 +
:<html><body>
 +
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/e/e6/2011.08.24_API2-MALT1_10.100%E5%80%8D%E5%B8%8C%E9%87%88.JPG" width="250px" height="250px" border="0">
 +
</body></html>
 +
<br>
 +
左から順に2レーン；マーカー、3～6レーン；API2-MALT1（10倍希釈）、8～11レーン；API2-MALT1（100倍希釈）<br>
 +
バンドは何も見られなかった。
 +
<br>
 +
 +
==''８月２５日''==
 +
<b>Member</b>
 +
<br>
 +
:松浪
 +
<br>
 +
:API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
 +
 +
:API2-MALT1<br>
 +
:<table border=1 width="200px">
 +
:<tr><td width="100px" align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td></tr>
 +
:</table>
 +
 +
:DIAP2<br>
 +
:<table border=1 width="200px">
 +
:<tr><td width="100px" align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td></tr>
 +
:</table>
 +
 +
:PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
 +
<br>
 +
<b>Results</b>
 +
:泳動後の写真<BR>
 +
:<html><body>
 +
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/7/72/2011.08.25_API2-MALT1.DIAP2.JPG" width="250px" height="250px" border="0">
 +
</body></html>
 +
<br>
 +
左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；API2-MALT1、4・5レーン；DIAP2<br>
 +
API2-MALT1に関してバンドは見られなかった。DIAP2については予想される位置にバンドが見られた。
 +
<br>
 +
 +
==''８月２９日''==
 +
<b>Member</b>
 +
<br>
 +
:武田、横井川
 +
<br>
 +
:25日に確認したDIAP2をフェノールクロロホルム処理し、
 +
:pUAST-flag vectorとともに、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
 +
:DIAP2<br>
:DIAP2<br>
:<table border="0"><tr><td>
:<table border="0"><tr><td>
-
:<table border="0" width="150px">
+
:<table border="0">
-
:<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
+
:<tr><td>DIAP2</td></tr>
:</table>
:</table>
-
:<table border=1 width="250px">
+
:<table border="1" width="250">
-
:<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="100px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
+
:<tr><td width="150px" align="center">PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width="100px" align="right">44 µl</td></tr>
-
:<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
+
:<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
-
:<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
+
:<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 µl</td></tr>
-
:<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+
:<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
-
:<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
+
-
:<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
+
-
:<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
+
-
:<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
+
:</table>
:</table>
-
:</td><TD></TD><TD></TD><td>
+
:</td><td></td><td></td><td>
-
:<table border="0" width="100px">
+
:<table border="0">
-
:<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
+
:<tr><td>pUAST-flag vector</td></tr>
:</table>
:</table>
-
:<table border=1 width="400px">
+
:<table border="1" width="350">
-
:<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px" align=center>94°C</td><td width="100px" align=center>2min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+
:<tr><td width="250px" align="center">pUAST-flag vector(500 ng/µl)</td><td width="100px" align="right">10 µl</td></tr>
-
:<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
+
:<tr><td align="center">ddH<sub>2</sub>O</td><td align="right">34 µl</td></tr>
-
:<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>56.9°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+
:<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
-
:<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1min40sec</td></tr>
+
:<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 µl</td></tr>
-
:<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+
:<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
-
:<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
+
:</table>
:</table>
:</td></tr>
:</td></tr>
:</table>
:</table>
 +
 +
37°Cで20時間静置した。
<br>
<br>
-
2.全てのサンプルに大腸菌の増殖がみられた。
+
 
 +
==''８月３０日''==
 +
<b>Member</b>
<br>
<br>
 +
:武田、横井川
 +
<br>
 +
:25日に確認したDIAP2をフェノールクロロホルム処理し、
 +
:pUAST-flag vectorとともに、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
 +
:<table border="0"><tr><td>
 +
:<table border="0">
 +
:<tr><td>DIAP2</td></tr>
 +
:</table>
 +
:<table border="1" width="250">
 +
:<tr><td width="150px" align="center">PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width="100px" align="right">44 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align="center">10 x M Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align="center"><i>Xba</i>Ⅰ</td><td align="right">1 µl</td></tr>
 +
:<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
 +
:</table>
 +
:</td><td></td><td></td><td>
 +
:<table border="0">
 +
:<tr><td>pUAST-flag vector</td></tr>
 +
:</table>
 +
:<table border="1" width="350">
 +
:<tr><td width="250px" align="center">pUAST-flag vector(500 ng/µl)</td><td width="100px" align="right">10 μl</td></tr>
 +
:<tr><td align="center">ddH<sub>2</sub>O</td><td align="right">34 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 µl</td></tr>
 +
:<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
 +
:</table></td></tr></table>
 +
 +
37°Cで20時間静置した 。
 +
<br>
 +
 +
==''８月３１日''==
 +
<b>Member</b>
 +
<br>
 +
:武田、横井川
 +
<br>
 +
:[http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx QIAquick Gel Extraction Kit]を使用してゲルからDIAP2のDNAとpUAST-flag vectorを抽出した。
 +
<br>
 +
<b>Results</b>
 +
:ゲル切り出し後の写真<br>
 +
:<html><body>
 +
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/2/27/2011.08.31_%E6%A8%AA%E4%BA%95%E5%B7%9DpUAST-flag-vector.JPG" width="240px" height="280px" border="0">
 +
</body></html>
 +
<br>
 +
:pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375 ng/µlであった。
 +
:DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。
 +
<br>
</div>
</div>

Latest revision as of 16:29, 5 October 2011



Home Team Project Parts Notebook Safety Human Practice Attributions


Home > Notebook > Lab Note > August Language：English/Japanese

８月８日

Member

松浪、横井川


API2-MALT1、DIAP2について以下のプライマーを用いて、以下の条件でPCRを行った。


API2-MALT1
F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
Tm値　57.8°C
R　primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値　56.5°C
増幅サイズ　　約3131 bp
DIAP2
F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値　69°C
R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値　66.4°C
増幅サイズ　　約1514 bp


1.API2-MALT1
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling51.5°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 


2.DIAP2
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling56.9°C30sec
Extension72°C1min40sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 


８月９日

Member

松浪、横井川


1.PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。
2.pUAST溶液のトランスフォーメーションを行った。


Results

1.泳動後の写真


1レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；DIAP2
2つとも予想される位置にバンドが確認されなかった。


2.コロニーの生育がみられた。


８月１０日

Member

松浪


1.API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でPCRを行った。
2.pUASTのプレカルチャー


Results

2.全てのサンプルに大腸菌の増殖がみられた。


８月１１日

Member

松浪


pUAST flag vectorのアルカリミニプレップをした後、プラスミドの確認をするため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2～9レーン；pUAST、10レーン；flag、11レーン；API2-MALT1、12レーン；DIAP2
pUASTは予想される位置にバンドが確認されたが、API2-MALT1、DIAP2は確認されなかった。


８月１２日

Member

松浪、横井川


1.pUAST flag vectorのアルカリミディプレップをした後、DNA濃度測定を行った。
2.プラスミドの確認をするため、電気泳動を行った。


Results

1.サンプル1、2の吸光度を測定した結果を以下に示す（表1）。


表1、サンプル1、2の吸光度の値
サンプル1
0.1890.2080.1920.1900.191
平均は0.194であった。
これより、サンプル1のDNA濃度は0.970 µg/µlであった。


サンプル2
0.2820.2760.2780.2690.269
平均は0.275でった。
これより、サンプル2のDNA濃度は1.37 µg/µlであった。


2.:泳動後の写真


左がマーカー(1kb)、右から順にサンプル1、サンプル2、flagである。
予想される位置にバンドが見られた。


８月１５日

Member

松浪、横井川


API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
API2-MALT1
Anneling58.9°C
DIAP2
Anneling53°C
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；DIAP2
API2-MALT1は予想される位置にバンドが確認されず、DIAP2は複数本のバンドが見られた。


８月１６日

Member

松浪


API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
API2-MALT1
Anneling53°C
DIAP2
Anneling58.9°C
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2
3レーン目のAPI2-MALT1は2 Kbpと3 Kbpにバンドが見られた。DIAP2はプライマーの特異性を高めたが、期待される位置にバンドはでなかった。

８月１７日

Member

松浪、横井川


API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
API2-MALT1
Anneling53.5°C
DIAP2
Anneling50.5°C
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


右から順に1レーン；マーカー、2・3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2
API2-MALT1は前回の条件でPCRしたが、前回より3 Kbpのバンドが薄くなった。DIAP2は予想された位置にバンドが見えなかった。

８月２３日

Member

松浪


API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
API2-MALT1
Anneling53°C
DIAP2
Anneling50.5°C
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2レーン；API2-MALT1、3レーン；API2-MALT1、4レーン；DIAP2、5レーン；DIAP2
API2-MALT1についてDNAポリメラーゼを変更したが、期待されるバンドは見られなかった。

８月２４日

Member

松浪


API2-MALT1について10、100倍希釈後、以下の条件でPCRを行った。
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling51.5°C30sec
Extension72°C3min20sec
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


左から順に2レーン；マーカー、3～6レーン；API2-MALT1（10倍希釈）、8～11レーン；API2-MALT1（100倍希釈）
バンドは何も見られなかった。

８月２５日

Member

松浪


API2-MALT1、DIAP2について、８月８日と同じ条件でAnnelingを以下のように変更してPCRを行った。
API2-MALT1
Anneling51.5°C
DIAP2
Anneling50.5°C
PCR産物が増幅していることを確認するため、電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


左から順に1レーン；マーカー（1 Kbp）、2・3レーン；API2-MALT1、4・5レーン；DIAP2
API2-MALT1に関してバンドは見られなかった。DIAP2については予想される位置にバンドが見られた。

８月２９日

Member

武田、横井川


25日に確認したDIAP2をフェノールクロロホルム処理し、
pUAST-flag vectorとともに、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x H Buffer5 µl
XhoⅠ1 µl
 total 50 µl
pUAST-flag vector
pUAST-flag vector(500 ng/µl)10 µl
ddH2O34 µl
10 x H Buffer5 µl
XhoⅠ1 µl
 total 50 µl

37°Cで20時間静置した。

８月３０日

Member

武田、横井川


25日に確認したDIAP2をフェノールクロロホルム処理し、
pUAST-flag vectorとともに、下表に従って制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x M Buffer5 µl
XbaⅠ1 µl
 total 50 µl
pUAST-flag vector
pUAST-flag vector(500 ng/µl)10 μl
ddH2O34 µl
10 x H Buffer5 µl
XhoⅠ1 µl
 total 50 µl

37°Cで20時間静置した 。

８月３１日

Member

武田、横井川


[http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx QIAquick Gel Extraction Kit]を使用してゲルからDIAP2のDNAとpUAST-flag vectorを抽出した。


Results

ゲル切り出し後の写真


pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375 ng/µlであった。
DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。


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