Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNote/GFPMLF8

22nd, August

Members

Yoshimura, Nakagawa, Matsunami

We have transformed E. coli DH5 alpha with the plasmid BBa_E0240.

Results

The transformed bacterial colonies were obtained.

22rd, August

Members

Yoshimura, Nakagawa

1. Pre-culture of bacteria transformed with BBa_E0240.

2. Design of primers to construct GFP plasmid without ATG from the plasmid BBa_E0240.

Results

1. We have succeeded the preculture.

2. The designed primers are shown below.

F: 3' TTGAATTCTTTCTAGATTCGTAAAGGAGAAGAA

　　　　　 　　 EcoRⅠ　　　XbaⅠ

Tmvalue:67.75°C　　33 base

R: 5' AAACTGCAGAAAACTAGTTTTTTATTATTTGTATAG

　　　　　 　 　　 PstⅠ　　　SpeⅠ

Tmvalue:67.66°C　　36 base

24th, August

Members

Yoshimura、Nakagawa

After isolation of plasmid DNA BBa_E0240 by the alkaline-lysis method, DNA samples were digested by the following restriction enzymes at 37 ℃ for 30 min.

ddH2O	2 µl
BBa_E0240	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

After restriction enzyme digestion, samples were electrophoresed in 1% agarose gel at 100 V for 30min.

Results

DNA bands in the agarose gel.

You can see DNA band at around 800bp.

25th, August

Members

Yoshimura、Nakagawa

PCR reaction was carried out by using primers designed on 23rd. The reaction conditions are summarized below.

PCR条件 10 µM GFP Primer F 1.5 µl 10 µM GFP Primer R 1.5 µl BBa_E0240 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl   total 50 µl

Cycle条件 Pre-Denature 95°C 30sec   Denature 95°C 30sec 30 Cycle Anneling 50°C 1min Extension 68°C 1min End 4°C keep

Agarose gel electrophoresis was carried out to detect the PCR products.

Then the PCR products were digested with the following restriction enzymes (at 37°C for 16 hours).

ddH2O	2 µl
BBa_E0240	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

Results

DNA bands in the agarose gel.

You can see DNA band at around 800bp.

８月２６日

Member

中川

1.ゲルからのDNA抽出

2.pSB1C3のトランスフォーメーション

Results

1.ゲル切り出し後の写真

濃度は510 ng/µlだった。

2.小さいが、コロニーが生えていた。念のために、翌日再度トランスフォーメーションをする。

８月２７日

Member

吉村

pSB1C3のトランスフォーメーション

Results

小さいコロニーの生育がみられた。

８月２９日

Member

吉村、中川

pSB1C3のプレカルチャー(6サンプル)

Results

6サンプルのうち3サンプルは培養に成功した。

3サンプルはコンタミの可能性があるため、念を入れて翌日もプレカルチャーを行うことにした。

８月３０日

Member

中川

1.pSB1C3のプレカルチャー(6サンプル)

2.プライマーの再設計

Results

1.コンタミすることなく培養に成功した。

2.以下のように設計した。

F: 3' TTGAATTCTTTTCTAGATTTCGTAAAGGAGAAGAA

　　　　　 　　 EcoRⅠ　 　　XbaⅠ

Tm値:68.8゜C　　35塩基

８月３１日

Member

中川

pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理をした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。

ddH2O	2 µl
BBa_E0240	50 µl
EcoRⅠ	1 µl
PstⅠ	1 µl
10 x H Buffer	6 µl
	total 60 µl

制限酵素処理後、100 V 30minで電気泳動を行った。

Results

泳動後の写真