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Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNote/GFPMLF8J
From 2011.igem.org
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| + | :プライマーの再設計 | ||
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| + | :1.コンタミすることなく培養に成功した。 | ||
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Revision as of 15:01, 3 October 2011
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| Home | Team | Project | Parts | Notebook | Safety | Human Practice | Attributions |
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| Home > Notebook > Lab Note > August | Language：English/Japanese |
|---|
８月２２日
Member
- 吉村、中川、松浪
Purpose
- BBa_E0240のトランスフォーメーション
Results
- コロニーの生育がみられた。
８月２３日
Member
- 吉村、中川
Purpose
- 1.BBa_E0240のプレカルチャー
- 2.BBa_E0240からATG GFPを作るためのプライマー設計
Results
- 1.全てのサンプルに大腸菌の増殖がみられた。
- 2.以下のように設計した。
- F: 3' TTGAATTCTTTCTAGATTCGTAAAGGAGAAGAA
- F: 3' TTGAATTCTTTCTAGATTCGTAAAGGAGAAGAA
EcoRⅠ XbaⅠ
- Tm値:67.75°C 33塩基
- Tm値:67.75°C 33塩基
- R: 5' AAACTGCAGAAAACTAGTTTTTTATTATTTGTATAG
- R: 5' AAACTGCAGAAAACTAGTTTTTTATTATTTGTATAG
PstⅠ SpeⅠ
- Tm値:67.66°C 36塩基
８月２４日
Member
- 吉村、中川
Purpose
- BBa_E0240のアルカリミニプレップ
- BBa_E0240のアガロース電気泳動
Method
- BBa_E0240のアルカリミニプレップをした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。
ddH2O 2 µl BBa_E0240 50 µl EcoRⅠ 1 µl PstⅠ 1 µl 10 x H Buffer 6 µl total 60 µl
- 制限酵素処理後、100 V 30minでアガロース電気泳動行った。
Results
- 泳動後の写真
-
- 800bpあたりにバンドが出ていた。
８月２５日
Member
- 吉村、中川
Purpose
- PCR(23日に作製したプライマーを用いた)
- アガロース電気泳動(PCR産物の増幅確認)
Method
- 以下の条件でPCRを行った。
PCR条件 10 µM GFP Primer F 1.5 µl 10 µM GFP Primer R 1.5 µl BBa_E0240 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl total 50 µl Cycle条件 Pre-Denature 95°C 30sec Denature 95°C 30sec 30 Cycle Anneling 50°C 1min Extension 68°C 1kb/min End 4°C keep
- PCR産物が増幅していることを確認するため、アガロース電気泳動を行った。
- PCR産物の増幅を確認した後、下表に従ってPCR産物の制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
ddH2O 2 µl BBa_E0240 50 µl EcoRⅠ 1 µl PstⅠ 1 µl 10 x H Buffer 6 µl total 60 µl
Results
- 泳動後の写真
-
- 800bpあたりにバンドが見られ、PCR産物の増幅が確認できた。
８月２６日
Member
- 中川
Purpose
- 1.ゲルからのDNA抽出
- 2.pSB1C3のトランスフォーメーション
Results
- 1.ゲル切り出し後の写真
-
- 濃度は510 ng/µlだった。
- 2.小さいが、コロニーが生えていた。念のために、翌日再度トランスフォーメーションをする。
８月２７日
Member
- 吉村
Purpose
- pSB1C3のトランスフォーメーション
Results
- 小さいコロニーの生育がみられた。
８月２９日
Member
- 吉村、中川
Purpose
- pSB1C3のプレカルチャー(6サンプル)
Results
- 6サンプルのうち3サンプルは培養に成功した。
- 3サンプルはコンタミの可能性があるため、念を入れて翌日もプレカルチャーを行うことにした。
８月３０日
Member
- 中川
Purpose
- 1.pSB1C3のプレカルチャー(6サンプル)
- プライマーの再設計
Results
- 1.コンタミすることなく培養に成功した。
- 2.以下のように設計した。
- F: 3' TTGAATTCTTTTCTAGATTTCGTAAAGGAGAAGAA
- F: 3' TTGAATTCTTTTCTAGATTTCGTAAAGGAGAAGAA
EcoRⅠ XbaⅠ
- Tm値:68.8゜C 35塩基
- Tm値:68.8゜C 35塩基
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