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Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNote/GFPMLF8J
From 2011.igem.org
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::<span style="FONT-FAMILY: 'ArialMT','sans-serif'; mso-hansi-font-family: ArialMT; mso-bidi-font-family: 'Times New Roman'" lang="EN-US"> F: 3' TT<span style="COLOR: red">GAATTC</span>TT<span style="COLOR: red">TCTAGA</span>TTCGTAAAGGAGAAGAA<br> | ::<span style="FONT-FAMILY: 'ArialMT','sans-serif'; mso-hansi-font-family: ArialMT; mso-bidi-font-family: 'Times New Roman'" lang="EN-US"> F: 3' TT<span style="COLOR: red">GAATTC</span>TT<span style="COLOR: red">TCTAGA</span>TTCGTAAAGGAGAAGAA<br> | ||
<em>Eco</em>RⅠ <em>Xba</em>Ⅰ<br> | <em>Eco</em>RⅠ <em>Xba</em>Ⅰ<br> | ||
| - | ::Tm値:67. | + | ::Tm値:67.75°C 33塩基<br> |
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::R: 5' AAA<font color="#ff0000">CTGCAG</font>AAA<font color="#ff0000">ACTAGT</font>TTTTTATTATTTGTATAG<br> | ::R: 5' AAA<font color="#ff0000">CTGCAG</font>AAA<font color="#ff0000">ACTAGT</font>TTTTTATTATTTGTATAG<br> | ||
<em>Pst</em>Ⅰ <em>Spe</em>Ⅰ<br> | <em>Pst</em>Ⅰ <em>Spe</em>Ⅰ<br> | ||
| - | ::Tm値:67. | + | ::Tm値:67.66°C 36塩基 |
==''８月２４日''== | ==''８月２４日''== | ||
<b>Member</b> | <b>Member</b> | ||
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<b>Purpose</b> | <b>Purpose</b> | ||
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:800bpあたりにバンドが出ていた。 | :800bpあたりにバンドが出ていた。 | ||
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| - | 以下の条件でPCRを行った。 | + | :以下の条件でPCRを行った。 |
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:<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr> | :<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr> | ||
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| - | :<tr><td width="100px" align=center> | + | :<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px" align=center>95°C</td><td width="100px" align=center>30sec</td><td width="100px"> </td></tr> |
| - | :<tr><td align=center | + | :<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>95°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>30 Cycle</td></tr> |
| - | :<tr><td align= | + | :<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50°C</td><td align=center>1min</td></tr> |
| - | :<tr><td align= | + | :<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr> |
| - | :<tr><td align=center>End</td><td align= | + | :<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px"> </td></tr> |
:</table> | :</table> | ||
:</td></tr> | :</td></tr> | ||
:</table> | :</table> | ||
| + | :PCR産物が増幅していることを確認するため、アガロース電気泳動を行った。 | ||
| + | :PCR産物の増幅を確認した後、下表に従ってPCR産物の制限酵素処理を行った。(37°C、overnight) | ||
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| - | + | :<tr><td width="130px" align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td width="90px" align=right>2 µl</td></tr> | |
| + | :<tr><td align=center>BBa_E0240</td><td align=right>50 µl</td></tr> | ||
| + | :<tr><td align=center><em>Eco</em>RⅠ</td><td align=right>1 µl</td></tr> | ||
| + | :<tr><td align=center><em>Pst</em>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr> | ||
| + | :<tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>6 µl</td></tr> | ||
| + | :<tr><td align=center> </td><td align=right>total 60 µl</td></tr> | ||
| + | :</table> | ||
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| + | <b>Results</b> | ||
| + | :泳動後の写真<BR> | ||
| + | :<html><body> | ||
| + | <IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/1/16/2011.08.25_GFP.JPG" width="250px" height="250px" border="0"> | ||
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| + | :800bpあたりにバンドが見られ、PCR産物の増幅が確認できた。 | ||
Revision as of 14:49, 3 October 2011
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| Home | Team | Project | Parts | Notebook | Safety | Human Practice | Attributions |
|---|
| Home > Notebook > Lab Note > August | Language：English/Japanese |
|---|
８月２２日
Member
- 吉村、中川、松浪
Purpose
- BBa_E0240のトランスフォーメーション
Results
- コロニーの生育がみられた。
８月２３日
Member
- 吉村、中川
Purpose
- 1.BBa_E0240のプレカルチャー
- 2.BBa_E0240からATG GFPを作るためのプライマー設計
Results
- 1.全てのサンプルに大腸菌の増殖がみられた。
- 2.以下のように設計した。
- F: 3' TTGAATTCTTTCTAGATTCGTAAAGGAGAAGAA
- F: 3' TTGAATTCTTTCTAGATTCGTAAAGGAGAAGAA
EcoRⅠ XbaⅠ
- Tm値:67.75°C 33塩基
- Tm値:67.75°C 33塩基
- R: 5' AAACTGCAGAAAACTAGTTTTTTATTATTTGTATAG
- R: 5' AAACTGCAGAAAACTAGTTTTTTATTATTTGTATAG
PstⅠ SpeⅠ
- Tm値:67.66°C 36塩基
８月２４日
Member
- 吉村、中川
Purpose
- BBa_E0240のアルカリミニプレップ
- BBa_E0240の電気泳動
Method
- BBa_E0240のアルカリミニプレップをした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。
ddH2O 2 µl BBa_E0240 50 µl EcoRⅠ 1 µl PstⅠ 1 µl 10 x H Buffer 6 µl total 60 µl
- 制限酵素処理後、100 V 30minで電気泳動した。
Results
- 泳動後の写真
-
- 800bpあたりにバンドが出ていた。
８月２５日
Member
- 吉村、中川
Purpose
- PCR(23日に作製したプライマーを用いた)
- アガロース電気泳動(PCR産物の増幅確認)
Method
- 以下の条件でPCRを行った。
PCR条件 10 µM GFP Primer F 1.5 µl 10 µM GFP Primer R 1.5 µl BBa_E0240 1 µl 10 x PCR Buffer for KOD Plus 5 µl dNTPs 4 µl MgSO4 4 µl ddH2O 32 µl KOD Plus 1 µl total 50 µl Cycle条件 Pre-Denature 95°C 30sec Denature 95°C 30sec 30 Cycle Anneling 50°C 1min Extension 68°C 1kb/min End 4°C keep
- PCR産物が増幅していることを確認するため、アガロース電気泳動を行った。
- PCR産物の増幅を確認した後、下表に従ってPCR産物の制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
ddH2O 2 µl BBa_E0240 50 µl EcoRⅠ 1 µl PstⅠ 1 µl 10 x H Buffer 6 µl total 60 µl
Results
- 泳動後の写真
-
- 800bpあたりにバンドが見られ、PCR産物の増幅が確認できた。
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