Team:KIT-Kyoto/Notebook/LabNote/GFPMLF8J

From 2011.igem.org

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:吉村、中川、松浪
:吉村、中川、松浪
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<b>Purpose</b>
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:BBa_E0240のトランスフォーメーションをした。
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:BBa_E0240のトランスフォーメーション
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<b>Results</b>
<b>Results</b>
:コロニーの生育がみられた。
:コロニーの生育がみられた。
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==''８月２３日''==
==''８月２３日''==
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:吉村、中川
:吉村、中川
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<b>Purpose</b>
 
:1.BBa_E0240のプレカルチャー<br>
:1.BBa_E0240のプレカルチャー<br>
:2.BBa_E0240からATG GFPを作るためのプライマー設計<br>
:2.BBa_E0240からATG GFPを作るためのプライマー設計<br>
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:1.全てのサンプルに大腸菌の増殖がみられた。
:1.全てのサンプルに大腸菌の増殖がみられた。
:2.以下のように設計した。
:2.以下のように設計した。
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::<span style="FONT-FAMILY: 'ArialMT','sans-serif'; mso-hansi-font-family: ArialMT; mso-bidi-font-family: 'Times New Roman'" lang="EN-US"> F: 3' TT<span style="COLOR: red">GAATTC</span>TT<span style="COLOR: red">TCTAGA</span>TTCGTAAAGGAGAAGAA<br>
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::F: 3' TT<span style="COLOR: red">GAATTC</span>TT<span style="COLOR: red">TCTAGA</span>TTCGTAAAGGAGAAGAA<br>
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　　　　　<em>Eco</em>RⅠ　　　　<em>Xba</em>Ⅰ<br>
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　　　　　     　　 <em>Eco</em>RⅠ　　　<em>Xba</em>Ⅰ<br>
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::Tm値:67.75゜C　　33塩基<br>
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::Tm値:67.75°C　　33塩基<br>
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::R: 5' AAA<font color="#ff0000">CTGCAG</font>AAA<font color="#ff0000">ACTAGT</font>TTTTTATTATTTGTATAG<br>
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　　　　　 <em>Pst</em>Ⅰ　　　　　<em>Spe</em>Ⅰ<br>
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　　　　　   　 　　 <em>Pst</em>Ⅰ　　　<em>Spe</em>Ⅰ<br>
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::Tm値:67.66゜C　　36塩基
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::Tm値:67.66°C　　36塩基
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==''８月２４日''==
==''８月２４日''==
<b>Member</b>
<b>Member</b>
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吉村、中川
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:吉村、中川
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<b>Purpose</b>
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:BBa_E0240のアルカリミニプレップ
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:BBa_E0240の電気泳動
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:BBa_E0240のアルカリミニプレップをした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。
:BBa_E0240のアルカリミニプレップをした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。
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:</table>
:</table>
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:制限酵素処理後、100 V 30minで電気泳動した。
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:制限酵素処理後、100 V 30minでアガロース電気泳動行った。
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<b>Results</b>
<b>Results</b>
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:<html><body>
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<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/3/30/2011.08.24_%E3%83%99%E3%82%AF%E3%82%BF%E3%83%BC.JPG" width="250px" height="250px" border="0">
<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/3/30/2011.08.24_%E3%83%99%E3%82%AF%E3%82%BF%E3%83%BC.JPG" width="250px" height="250px" border="0">
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</body></html><BR>
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</body></html>
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:800bpあたりにバンドが出ていた。
:800bpあたりにバンドが出ていた。
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==''８月２５日''==
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<b>Member</b>
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:吉村、中川<br>
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:23日に作製したプライマーを用いて、以下の条件でPCRを行った。
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:<table border="0"><tr><td>
 +
:<table border="0" width="150px">
 +
:<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
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:</table>
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:<table border=1 width="250px">
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:<tr><td width="150px" align=center>10 µM GFP Primer F</td><td width="100px"  align=right>1.5 µl</td></tr>
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:<tr><td align=center>10 µM GFP Primer R</td><td align=right>1.5 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>BBa_E0240</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>10 x PCR Buffer for KOD Plus</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>dNTPs</td><td align=right>4 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>MgSO<sub>4</sub></td><td align=right>4 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>32 µl</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>KOD Plus</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
:<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
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:</table>
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:</td><TD></TD><TD></TD><td>
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:<table border="0" width="100px">
 +
:<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
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:</table>
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:<table border=1 width="400px">
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:<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px" align=center>95°C</td><td width="100px" align=center>30sec</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>95°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>30 Cycle</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50°C</td><td align=center>1min</td></tr>
 +
:<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>68°C</td><td align=center>1min</td></tr>
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:<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
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:</table>
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:</td></tr>
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:</table>
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:PCR産物が増幅していることを確認するため、アガロース電気泳動を行った。
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:PCR産物の増幅を確認した後、下表に従ってPCR産物の制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
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:<table border=1 width="220px">
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:<tr><td width="130px" align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td width="90px"  align=right>2 µl</td></tr>
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:<tr><td align=center>BBa_E0240</td><td align=right>50 µl</td></tr>
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:<tr><td align=center><em>Eco</em>RⅠ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
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:<tr><td align=center><em>Pst</em>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
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:<tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>6 µl</td></tr>
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:<tr><td align=center>&nbsp;</td><td align=right>total 60 µl</td></tr>
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:</table>
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<b>Results</b>
 +
:泳動後の写真<BR>
 +
:<html><body>
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<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/1/16/2011.08.25_GFP.JPG" width="250px" height="250px" border="0">
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</body></html>
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<br>
 +
:800bpあたりにバンドが見られ、PCR産物の増幅が確認できた。
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==''８月２６日''==
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<b>Member</b>
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:中川<br>
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<br>
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:1.ゲルからのDNA抽出
 +
:2.pSB1C3のトランスフォーメーション
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<br>
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<b>Results</b>
 +
:1.ゲル切り出し後の写真<BR>
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:<html><body>
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<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/c/ce/8.26GFP%E3%82%B2%E3%83%AB%E6%8A%BD.jpg" width="250px" height="250px" border="0">
 +
</body></html>
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 +
:濃度は510 ng/µlだった。
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:2.小さいが、コロニーが生えていた。念のために、翌日再度トランスフォーメーションをする。
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==''８月２７日''==
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<b>Member</b>
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:吉村
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:pSB1C3のトランスフォーメーション
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 +
<b>Results</b>
 +
:小さいコロニーの生育がみられた。
 +
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==''８月２９日''==
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<b>Member</b>
 +
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 +
:吉村、中川
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:pSB1C3のプレカルチャー(6サンプル)
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<b>Results</b>
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:6サンプルのうち3サンプルは培養に成功した。
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:3サンプルはコンタミの可能性があるため、念を入れて翌日もプレカルチャーを行うことにした。
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==''８月３０日''==
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<b>Member</b>
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:中川<br>
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:1.pSB1C3のプレカルチャー(6サンプル)
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:2.プライマーの再設計
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<b>Results</b>
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:1.コンタミすることなく培養に成功した。
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:2.以下のように設計した。
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::F: 3' TT<span style="COLOR: red">GAATTC</span>TTT<span style="COLOR: red">TCTAGA</span>TTTCGTAAAGGAGAAGAA<br>
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　　　　　    　　 <em>Eco</em>RⅠ　  　　<em>Xba</em>Ⅰ<br>
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::Tm値:68.8゜C　　35塩基<br>
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==''８月３１日''==
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<b>Member</b>
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:中川<br>
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:pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理をした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。
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:<table border=1 width="220px">
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:<tr><td width="130px" align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td width="90px"  align=right>2 µl</td></tr>
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:<tr><td align=center>BBa_E0240</td><td align=right>50 µl</td></tr>
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:<tr><td align=center><em>Eco</em>RⅠ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
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:<tr><td align=center><em>Pst</em>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
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:<tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>6 µl</td></tr>
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:<tr><td align=center>&nbsp;</td><td align=right>total 60 µl</td></tr>
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:制限酵素処理後、100 V 30minで電気泳動を行った。
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<b>Results</b>
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:泳動後の写真<BR>
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:<html><body>
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<IMG src="https://static.igem.org/mediawiki/2011/f/f2/2011.08.31.JPG" width="250px" height="250px" border="0">
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</body></html>
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Latest revision as of 10:38, 4 October 2011



Home Team Project Parts Notebook Safety Human Practice Attributions


Home > Notebook > Lab Note > August Language：English/Japanese

８月２２日

Member

吉村、中川、松浪


BBa_E0240のトランスフォーメーションをした。


Results

コロニーの生育がみられた。


８月２３日

Member

吉村、中川


1.BBa_E0240のプレカルチャー
2.BBa_E0240からATG GFPを作るためのプライマー設計


Results

1.全てのサンプルに大腸菌の増殖がみられた。
2.以下のように設計した。
F: 3' TTGAATTCTTTCTAGATTCGTAAAGGAGAAGAA

　　　　　 　　 EcoRⅠ　　　XbaⅠ

Tm値:67.75°C　　33塩基


R: 5' AAACTGCAGAAAACTAGTTTTTTATTATTTGTATAG

　　　　　 　 　　 PstⅠ　　　SpeⅠ

Tm値:67.66°C　　36塩基


８月２４日

Member

吉村、中川


BBa_E0240のアルカリミニプレップをした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。
ddH2O2 µl
BBa_E024050 µl
EcoRⅠ1 µl
PstⅠ1 µl
10 x H Buffer6 µl
 total 60 µl


制限酵素処理後、100 V 30minでアガロース電気泳動行った。


Results

泳動後の写真


800bpあたりにバンドが出ていた。


８月２５日

Member

吉村、中川


23日に作製したプライマーを用いて、以下の条件でPCRを行った。
PCR条件
10 µM GFP Primer F1.5 µl
10 µM GFP Primer R1.5 µl
BBa_E02401 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs4 µl
MgSO44 µl
ddH2O32 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature95°C30sec 
Denature95°C30sec30 Cycle
Anneling50°C1min
Extension68°C1min
End4°Ckeep 
PCR産物が増幅していることを確認するため、アガロース電気泳動を行った。
PCR産物の増幅を確認した後、下表に従ってPCR産物の制限酵素処理を行った。(37°C、overnight)
ddH2O2 µl
BBa_E024050 µl
EcoRⅠ1 µl
PstⅠ1 µl
10 x H Buffer6 µl
 total 60 µl


Results

泳動後の写真


800bpあたりにバンドが見られ、PCR産物の増幅が確認できた。


８月２６日

Member

中川


1.ゲルからのDNA抽出
2.pSB1C3のトランスフォーメーション


Results

1.ゲル切り出し後の写真


濃度は510 ng/µlだった。


2.小さいが、コロニーが生えていた。念のために、翌日再度トランスフォーメーションをする。


８月２７日

Member

吉村


pSB1C3のトランスフォーメーション


Results

小さいコロニーの生育がみられた。


８月２９日

Member

吉村、中川


pSB1C3のプレカルチャー(6サンプル)


Results

6サンプルのうち3サンプルは培養に成功した。
3サンプルはコンタミの可能性があるため、念を入れて翌日もプレカルチャーを行うことにした。


８月３０日

Member

中川


1.pSB1C3のプレカルチャー(6サンプル)
2.プライマーの再設計


Results

1.コンタミすることなく培養に成功した。
2.以下のように設計した。
F: 3' TTGAATTCTTTTCTAGATTTCGTAAAGGAGAAGAA

　　　　　 　　 EcoRⅠ　 　　XbaⅠ

Tm値:68.8゜C　　35塩基


８月３１日

Member

中川


pSB1C3のアルカリミニプレップ、フェノールクロロホルム処理をした後、下表に従って、30分37℃で制限酵素処理を行った。
ddH2O2 µl
BBa_E024050 µl
EcoRⅠ1 µl
PstⅠ1 µl
10 x H Buffer6 µl
 total 60 µl


制限酵素処理後、100 V 30minで電気泳動を行った。


Results

泳動後の写真


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