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８/22(月)
吉村、中川、松浪
BBa_E0240(GFP+pSB1A2)のトランスフォーメーション
【目的】
BBa_E0240(GFP+pSB1A2)の増殖
【実験方法】
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した。
↓前もって冷やしておいた1.5 mLチューブに100 µLのコンピテント細胞を分注した。
↓BBa_E0240をチューブに1 µL加え、氷上で30分間冷やした。
↓42゜Cで45秒間熱ショックを与えた。
↓1 mLをLBプレート(+amp)にまいた。
↓37 Cで一晩インキュベートした。
【結果】
コロニーの生育がみられた。
8/23(火)
吉村、中川
BBa_E0240(GFP+pSB1A2)のプレカルチャー
【目的】
BBa_E0240(GFP+pSB1A2)の増殖
【実験方法】
LB/amp 液体培地(50 µg/mL)2 mLで6サンプルを37゜C、●●rpmで一晩、振とう培養した。
【結果】
全てのサンプルに大腸菌の増殖がみられた。
開始コドンなしのGFPのプライマー設計
【目的】
BBa_E0240(GFP+pSB1A2)から開始コドンなしのGFPを単離・増殖する。
【実験方法】
BBa_E0240(GFP+pSB1A2)から開始コドンなしのGFPの上流にEcoRⅠ、XbaⅠの制限酵素サイト、下流にSpeⅠ、Pst
Ⅰの制限酵素サイトがあるようにプライマー設計をした。
【結果】
以下のようにプライマーを設計した。
F: 3' TTGAATTCTTTCTAGATT
CGTAAAGGAGAAGAA
EcoRⅠ XbaⅠ
Tm値:67.75゜C 33塩基
R: 5' AAACTGCAGAAAACTAGTTTTTTATTATTTGTATAG
PstⅠ SpeⅠ
Tm値:67.66゜C 36塩基
8/24(水) 11:00～
吉村、中川
BBa_E0240のアルカリミニプレップ
【目的】
形質転換した大腸菌からBBa_E0240のプラスミドDNAを回収、精製する。
【実験方法】
↓前日のプレカルチャーで培養した培養液を1.5 mlチューブにうつし、15,000 rpm、4 ℃で5分間遠心し、上清を捨てた
↓100 μlの氷冷したSolution Iを加え、ボルテックスした
↓沈殿物を溶かした後、200 μlのSolution IIを加え、混ぜた
↓氷上で5分間冷やした
↓150 µlのSolution IIIを加え、混ぜた
↓氷上で5分間冷やした
↓15,000 rpm、4゜Cで10分間遠心した
↓上清を新しいチューブにとり、沈殿物は廃棄した
↓450 µlのイソプロパノールを加え、混ぜた
↓2分間室温で放置した
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てた
↓150～200 µlの70%エタノールを加え、軽くボルテックスした
↓2分間室温で放置した
↓15,000 rpm、室温で10分間遠心し、上清を捨てた
↓沈殿を10分～15分乾かした
↓RNaseのはいったTEを20 µl加えて37゜Cで培養した
【結果】
制限酵素処理に続く
制限酵素処理
【目的】
提出用ベクターに組み込むインサートの調整
【実験方法】
下表に従って、制限酵素処理を行った。
| MilliQ | 0.3 µl |
| BBa_E0240 | 5 µl |
| EcoRⅠ | 0.5 µl |
| PstⅠ | 0.5 µl |
| 10 x Buffer | 0.7 µl |
| | 全量 7 µl |
37゜Cで30分間インキュベートした。
【結果】
アガロースゲル電気泳動に続く
8/25(木) 11:00～
吉村、中川
PCR
【目的】
8/23に作製したプライマーを用いてGFPの特異的配列を増幅させる
【実験方法】
以下の条件でPCRを行った。
| 10 µM GFP Primer F | 1.5 µl |
| 10 µM GFP Primer R | 1.5 µl |
| 鋳型 DNA | 1 µl |
| 10 x PCR Buffer for KOD Plus | 5 µl |
| dNTPs | 4 µl |
| MgSO4 | 4 µl |
| ddH2O | 32 µl |
| KOD Plus | 1 µl |
| | 全量 50 µl |
| | |
| Start | 95°C、30秒 |
| Cycle x 30 | 95°C、30秒(熱変性) |
| (Tm-5)°C、1分(アニーリング) |
| 68°C、1kb/分(伸長) |
| End | 4°Cで保持 |
|
【結果】
アガロースゲル電気泳動に続く
8/26(金) 17:00～
ゲルからのDNA抽出
【目的】
GFPバンドを切り出し、そのゲル片からDNAを抽出・精製する。
【実験方法】
QIAquick
Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x
TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとマーカーをゲルにのせた
| 1 kbpマーカー | 3 ml |
| noATG GFP | 50 µl |
| Lording Dye | 7 ml |
↓50
Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50 Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした
【結果】
濃度は510
ng/µlだった。
ゲル切り出し後の写真
pSB1C3のトランスフォーメーション
【目的】
pSB1C3の増殖
【実験方法】
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した。
↓前もって冷やしておいた1.5 mLチューブに100 µLのコンピテント細胞を分注した。
↓pSB1C3をチューブに1 µL加え、氷上で30分間冷やした。
↓42゜Cで45秒間熱ショックを与えた。
↓1 mLをLBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。
【結果】
小さいが、コロニーが生えていた。
念のために、翌日再度トランスフォーメーションをする。
8/27(土)
吉村
pSB1C3のトランスフォーメーション
【目的】
pSB1C3の増殖
【実験方法】
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した。
↓前もって冷やしておいた1.5
mLチューブに100 µLのコンピテント細胞を分注した。
↓pSB1C3をチューブに1 µL加え、氷上で30分間冷やした。
↓42゜Cで45秒間熱ショックを与えた。
↓1 mLをLBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。
【結果】
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