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8/29(月)

武田、横井川

【目的】

PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho I）

【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄める
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置する
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加える
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する
↓上澄みを捨て、乾燥させる
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexする
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する

制限酵素処理(Xho I)
下記の組成に従って反応液を調整する下記の組成に従って反応液を調整する

cDNA PCR産物 in ddH2O 44 μl 10 x H Buffer 5 μl XhoⅠ 1 μl   total 50 μl

vector PUAST-flag vector(500 ng/μl) 10 μl ddH2O 34 μl 10 x H Buffer 5 μl XhoⅠ 1 μl   total 50 μl

37°Cで20時間静置する

8/30(火)

武田、横井川

【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目：Xba I)
【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400 µlまでddH₂Oで薄める
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓3M CH₃COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2～3min静置する
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加える
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する
↓上澄みを捨て、乾燥させる
↓ddH₂Oを44 µl加えてvoltexする
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する

制限酵素処理(Xba I)

下記の組成に従って反応液を調整する

DIAP2 PCR産物 in ddH2O 44 μl 10 x M Buffer 5 μl XbaⅠ 1 μl   total 50 μl

vector

PUAST-flag vector(500 ng/μl)	10 μl
ddH2O	34 μl
10 x H Buffer	5 μl
XhoⅠ	1 μl
	total 50 μl

37°Cで20時間静置する