Team:KIT-Kyoto/yokoigawa

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武田、横井川

【目的】

PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(一回目:Xho I

【実験操作】
PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄める
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2~3min静置する
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加える
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する
↓上澄みを捨て、乾燥させる
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexする
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する

制限酵素処理(Xho I)
下記の組成に従って反応液を調整する下記の組成に従って反応液を調整する

cDNA
PCR産物 in ddH2O44 μl
10 x H Buffer5 μl
Xho1 μl
 total 50 μl
vector
PUAST-flag vector(500 ng/μl)10 μl
ddH2O34 μl
10 x H Buffer5 μl
Xho1 μl
 total 50 μl
37°Cで20時間静置する