Team:KIT-Kyoto/yokoigawa

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武田、横井川

【目的】

PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(一回目:Xho 1

【実験操作】

~フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿~

DAIP2PCR産物を400μlまでmilliQで希釈し、フェノール・クロロホルムを400μl加えてvoltex 10000rpm3min4℃で遠心。

↓水層のみを新しいチューブに移した。

↓クロロホルムを等量加えて、voltex10000rpm3min4℃で遠心。

↓水層のみを新しいチューブに移し3M CH3COONa(PH 5.27)1/10等量加え、isopropanolを等量加えた。

3分静置後、14000rpm 10min 4℃で遠心。

↓遠心後、上清を捨て、70ethanol200μl加え、15000rpm 5min 4℃で遠心。

↓遠心後、上清を捨て乾燥させる。乾燥後milliQ44μlを加えてvoltexし、milliQ中にDNAを溶解させる。

~制限酵素処理~

フェノールクロロホルム処理後下記の反応液を調整した

反応液調整(cDNA

  PCR産物 in milliQ  44μl

  10x H Buffer    5μl

  Xho 1               1μl

 

  反応液調整(vector

      pUAST-flag vector(500ng/μl)  10μl

      milliQ                       34μl

      10x H Buffer                 5μl

      Xho 1                        1μl

 

↓反応液調整後、37℃で20時間静置




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武田、横井川

【目的】

PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目:Xbal)

【実験操作】

制限酵素処理20h後、フェノールクロロホルム処理を行う

PCR産物を400μlまでmilliQで希釈し、フェノール・クロロホルムを400μl加えてvoltex 10000rpm3min4℃で遠心。

↓水層のみを新しいチューブに移した。

↓クロロホルムを等量加えて、voltex10000rpm3min4℃で遠心。

↓水層のみを新しいチューブに移し3M CH3COONa(PH 5.27)1/10等量加え、isopropanolを等量加えた。

3分静置後、14000rpm 10min 4℃で遠心。

↓遠心後、上清を捨て、70ethanol200μl加え、15000rpm 5min 4℃で遠心。

↓遠心後、上清を捨て乾燥させる。乾燥後milliQ44μlを加えてvoltexし、milliQ中にDNAを溶解させる。

 

下記の反応液を調整する

 

反応液調整(DIAP2

  PCR産物 in milliQ  44μl

  10x M Buffer         5μl

  Xba 1                1μl

 

反応液調整(vector

  pUAST-flag vector in milliQ  44μl

  10x H Buffer                 5μl

  Xba 1                        1μl

 

↓反応液調整後、37℃で20時間静置