Team:KIT-Kyoto/yokoigawa

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<title></title>
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</head>
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<p>
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8/29(月)<BR>
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武田、横井川<BR>
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<BR>
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制限酵素処理<br>
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【目的】<BR>
 +
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(一回目:<i>Xho</i> I)<br>
 +
<BR>
 +
【実験操作】<br>
 +
PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)<br>
 +
↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた<br>
 +
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした<br>
 +
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した<br>
 +
↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
 +
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした<br>
 +
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した<br>
 +
↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
 +
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2~3min静置した<br>
 +
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した<br>
 +
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた<br>
 +
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した<br>
 +
↓上澄みを捨て、乾燥させた<br>
 +
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした<br>
 +
※保存する場合 ↓-20°Cで保存した<br>
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<br>
 +
<strong>制限酵素処理(<i>Xho</i> I)</strong><br>
 +
下記の組成に従って反応液を調整した<br>
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<table border="0"><tr><td>
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<table border="0">
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<tr><td>cDNA</td></tr>
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</table>
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<table border="1" width="200">
 +
<tr><td width?150px? align="center">PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width?50px? align="right">44 µl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
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</table>
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</td><td></td><td></td><td>
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<table border="0">
 +
<tr><td>vector</td></tr>
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</table>
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<table border="1" width="250">
 +
<tr><td width?200px? align="center">PUAST-flag vector(500 ng/µl)</td><td width?50px? align="right">10 µl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">ddH<sub>2</sub>O</td><td align="right">34 µl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
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</table>
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</td></tr>
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</table>
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37°Cで20時間静置した
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<br>
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8/30(火)<BR>
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武田、横井川<BR>
 +
<BR>
 +
制限酵素処理<br>
 +
【目的】<br>
 +
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目:<i>Xho</i> I)<br>
 +
【実験操作】<br>
 +
PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)<br>
 +
↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた<br>
 +
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした<br>
 +
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した<br>
 +
↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
 +
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした<br>
 +
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した<br>
 +
↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
 +
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2~3min静置した<br>
 +
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した<br>
 +
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 μl加えた<br>
 +
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した<br>
 +
↓上澄みを捨て、乾燥させた<br>
 +
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした<br>
 +
<br>
 +
<strong>制限酵素処理(Xba I)</strong></span></span></p><br>
 +
下記の組成に従って反応液を調整した<br>
 +
<table border="0"><tr><td>
 +
<table border="0">
 +
<tr><td>DIAP2</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border="1" width="200">
 +
<tr><td width?150px? align="center">PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width?50px? align="right">44 µl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">10 x M Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align="center"><i>Xba</i>Ⅰ</td><td align="right">1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
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</table>
 +
 +
<tr><td>vector</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border="1" width="250">
 +
<tr><td width?200px? align="center">PUAST-flag vector(500 ng/µl)</td><td width?50px? align="right">10 μl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">ddH<sub>2</sub>O</td><td align="right">34 µl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
 +
</table></td></tr></table>37°Cで20時間静置した <br>
 +
 +
8/31(水)<BR>
 +
武田、横井川<BR>
 +
ゲル抽出<br>
 +
【目的】<BR>
 +
制限酵素処理したPCR産物・vectorの精製<br>
 +
<BR>
 +
【実験操作】<BR>
 +
ゲルからのDNA抽出<br>
 +
<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
 +
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<br>
 +
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
 +
 +
<tr><td><table border="1" width="230">
 +
<tr><td width="130" align="center">1 kbpマーカー</td><td width="100"  align="right">5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">DIAP2 or PUAST-flag vector</td><td align="right">50 µl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">10 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
 +
 +
 +
↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
 +
↓EtBrでゲルを10分間染色した<br>
 +
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
 +
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした<br>
 +
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った<br>
 +
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた<br>
 +
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした<br>
 +
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した<br>
 +
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた<br>
 +
↓カラムにサンプルをのせた<br>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた<br>
 +
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした<br>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
 +
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた<br>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
 +
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
 +
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
 +
↓37 µlのMilliQを加えた<br>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
 +
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした<br>
 +
<BR>
 +
<BR>
 +
【結果】<BR>
 +
pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375 ng/µlであった。<BR>
 +
DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。<BR>
 +
 +
<BR>
 +
<BR>
 +
<BR>
 +
 +
9/1(木)<BR>
 +
武田<BR>
 +
<br>
 +
PCR<BR>
 +
【目的】<br>
 +
DIAP2のポリメラーゼ連鎖反応<br>
 +
<BR>
 +
【実験操作】<br>
 +
下記の組成に従って試薬をまぜた<br>
 +
右に示したプログラムで反応を行った<br>
 +
<table border="0"><tr><td>
 +
<table border="0" width="150">
 +
<tr><td align="center">PCR条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border="1" width="220">
 +
<tr><td width="150" align="center">10 µM Primer F</td><td width="70"  align="right">1.5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">10 µM Primer R</td><td align="right">1.5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">Template DNA</td><td align="right">1 µl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">10 x PCR Buffer</td><td align="right">5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">dNTPs</td><td align="right">5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">MgSO<sub>4</sub></td><td align="right">2 µl or 4 µl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">ddH<sub>2</sub>O</td><td align="right">33 µl or 31 µl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">KOD<sup>+</sup> polymelase</td><td align="right">1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</td><td></td><td></td><td>
 +
<table border="0" width="100">
 +
<tr><td align="center">Cycle条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border="1" width="400">
 +
        <tbody>
 +
<tr><td width="100" align="center">Pre-Denature</td><td width="100"  align="center">94°C</td><td width="100"  align="center">2min</td></td><td width="100">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align="center">Denature</td><td align="center">94°C</td><td align="center">15sec</td><td align="center" rowspan="3">35 Cyle</td></tr>
 +
<tr><td align="center">Anneling</td><td align="center">50.5°C</td><td align="center">30sec</td></tr>
 +
<tr><td align="center">Extension</td><td align="center">68°C</td><td align="center">100sec</td></tr>
 +
<tr><td align="center">End</td><td align="center">4°C</td><td align="center">keep</td><td width="100">&nbsp;</td></tr>
 +
</table></td></tr></tbody></table>
 +
 +
<BR>
 +
<BR>
 +
【目的】<BR>
 +
PCR産物の確認<br>
 +
<BR>
 +
【実験操作】<br>
 +
<strong>ゲル電気泳動</strong></p><BR>
 +
 +
 +
ゲル1枚当たりの組成
 +
<tr><td><table border="1" width="200">
 +
<tr><td width="150" align="center">SeaKem<sup>R</sup>GTG<sup>R</sup>-agar</td><td width="50" align="right">0.2 g</td></tr>
 +
<tr><td align="center">1 x TAE</td><td align="right">20 ml</td></tr>
 +
</table>
 +
 +
<br>
 +
 +
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた<br>
 +
↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加えた<br>
 +
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた<br>
 +
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動した<br>
 +
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した<br>
 +
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた<br>
 +
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
 +
【結果】<br>
 +
正しい位置にバンドが確認できた
 +
 +
<br>
 +
<BR>
 +
<BR>
 +
9/5(月)<BR>
 +
横井川<BR>
 +
制限酵素処理<br>
 +
【目的】<BR>
 +
DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(一回目:Xho I)<br>
 +
<BR>
 +
【実験操作】<br>
 +
PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)<br>
 +
↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた<br>
 +
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした<br>
 +
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した<br>
 +
↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
 +
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした<br>
 +
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した<br>
 +
↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
 +
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2~3min静置した<br>
 +
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した<br>
 +
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた<br>
 +
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した<br>
 +
↓上澄みを捨て、乾燥させた<br>
 +
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした<br>
 +
 +
 +
<br>
 +
<BR>
 +
 +
制限酵素処理(<i>Xho</i> I)<br>
 +
下記の組成に従って反応液を調整した<br>
 +
 +
<table border="0"><tr><td>
 +
<table border="0">
 +
<tr><td>cDNA</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border="1" width="200">
 +
<tr><td width?150px? align="center">PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width?50px? align="right">44 μl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 μl</td></tr>
 +
<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 μl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 μl</td></tr>
 +
</table>
 +
</td><td></td><td></td><td>
 +
<table border="0">
 +
<tr><td>vector</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border="1" width="250">
 +
<tr><td width?200px? align="center">PUAST-flag vector(500 ng/μl)</td><td width?50px? align="right">10 μl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">ddH<sub>2</sub>O</td><td align="right">34 μl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">10 x H Buffer</td><td align="right">5 μl</td></tr>
 +
<tr><td align="center"><i>Xho</i>Ⅰ</td><td align="right">1 μl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 μl</td></tr>
 +
</table>
 +
</td></tr>
 +
</table>
 +
 +
 +
37°Cで20時間静置した
 +
 +
<br></p>
 +
</body>
 +
 +
9/6(火)<BR>
 +
横井川<BR>
 +
<BR>
 +
制限酵素処理<br>
 +
【目的】<br>
 +
DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(二回目:Xba I)<br>
 +
<BR>
 +
【実験操作】<br>
 +
PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)<br>
 +
</strong>↓PCR産物を400 μlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた<br>
 +
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 μl加えてvoltexした<br>
 +
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した<br>
 +
↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
 +
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした<br>
 +
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した<br>
 +
↓水層のみを新しいチューブに移した<br>
 +
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2~3min静置した<br>
 +
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した<br>
 +
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 μl加えた<br>
 +
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した<br>
 +
↓上澄みを捨て、乾燥させた<br>
 +
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 μl加えてvoltexした<br>
 +
<br>
 +
 +
<br>
 +
<BR>
 +
 +
制限酵素処理(Xba I)<br>
 +
 +
下記の組成に従って反応液を調整した<br>
 +
 +
<table border="0"><tr><td>
 +
<table border="0">
 +
<tr><td>DIAP2</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border="1" width="200">
 +
<tr><td width?150px? align="center">PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width?50px? align="right">44 μl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">10 x M Buffer</td><td align="right">5 μl</td></tr>
 +
<tr><td align="center"><i>Xba</i>Ⅰ</td><td align="right">1 μl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 μl</td></tr>
 +
</table></td></tr></table>
 +
 +
37°Cで20時間静置した
 +
 +
<br>
 +
<BR>
 +
9/7(水)<BR>
 +
横井川<BR>
 +
ゲル抽出<br>
 +
【目的】<BR>
 +
制限酵素処理したDIAP2のPCR産物のゲル抽出<BR>
 +
<BR>
 +
【実験操作】<br>
 +
ゲルからのDNA抽出<br>
 +
<BR>
 +
<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
 +
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつった<br>
 +
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
 +
 +
<tr><td><table border="1" width="230">
 +
<tr><td width="130" align="center">1 kbp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 μl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">DIAP2</td><td align="right">50 μl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">10 μl</td></tr>
 +
</table>
 +
 +
 +
 +
↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
 +
↓EtBrでゲルを10分間染色した<br>
 +
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
 +
<BR>
 +
<BR>
 +
【結果】<BR>
 +
バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。<BR>
 +
 +
<BR>
 +
<BR>
 +
<BR>
 +
 +
9/17(土)<BR>
 +
制限酵素処理<br>
 +
【目的】<br>
 +
DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(二回目:Xba I)<br>
 +
<BR>
 +
【実験操作】<br>
 +
制限酵素処理(Xba I)<br>
 +
 +
下記の組成に従って反応液を調整した<br>
 +
 +
<table border="0"><tr><td>
 +
<table border="0">
 +
<tr><td>DIAP2</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border="1" width="200">
 +
<tr><td width?150px? align="center">PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width?50px? align="right">44 μl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">10 x M Buffer</td><td align="right">5 μl</td></tr>
 +
<tr><td align="center"><i>Xba</i>Ⅰ</td><td align="right">1 μl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align="right">total 50 μl</td></tr>
 +
</table></td></tr></table>37°Cで20時間静置した
 +
<br>
 +
<BR>
 +
 +
9/18(日)<BR>
 +
横井川<BR>
 +
LB培地<BR>
 +
 +
<tr><td><table border="1" width="200">
 +
<tr><td width="150" align="center">bacto tryptone</td><td width="50" align="right">10 g</td></tr>
 +
<tr><td align="center">bacto yeast evtract</td><td align="right">5 g</td></tr>
 +
<tr><td align="center">NaCl</td><td align="right">10 g</td></tr>
 +
</table>
 +
<br>
 +
↓LB培地用の試薬を計り、ビーカーに入れた<br>
 +
↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かした<br>
 +
↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをした<br>
 +
↓121°Cで20分オートクレーブ滅菌した<br>
 +
 +
 +
<br><br><br>
 +
 +
 +
ゲル抽出<br>
 +
【目的】<BR>
 +
制限酵素処理したDIAP2のPCR産物の精製<BR>
 +
<BR>
 +
【実験操作】<br>
 +
ゲルからのDNA抽出<br>
 +
<BR>
 +
<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用した<br>
 +
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<br>
 +
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
 +
 +
<tr><td><table border="1" width="230">
 +
<tr><td width="130" align="center">1 kbp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 μl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">DIAP2</td><td align="right">50 μl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">10 μl</td></tr>
 +
</table>
 +
↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
 +
↓EtBrでゲルを10分間染色した<br>
 +
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br></p>
 +
<BR>
 +
<BR>
 +
【結果】<BR>
 +
バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。<BR>
 +
<BR>
 +
<BR>
 +
<BR>
 +
9/20(火)<br>
 +
【目的】<BR>
 +
DIAP2のPCR産物の確認<br>
 +
<BR>
 +
【実験操作】<BR>
 +
ゲル電気泳動<BR>
 +
<BR>
 +
ゲル1枚当たりの組成
 +
<tr><td><table border="1" width="200">
 +
<tr><td width="150" align="center">SeaKem<sup>R</sup>GTG<sup>R</sup>-agar</td><td width="50" align="right">0.2 g</td></tr>
 +
<tr><td align="center">1 x TAE</td><td align="right">20 ml</td></tr>
 +
</table>
 +
<br>
 +
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた<br>
 +
↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加えた<br>
 +
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた<br>
 +
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動した<br>
 +
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した<br>
 +
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた<br>
 +
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
 +
<br>
 +
<BR>
 +
ゲル抽出<br>
 +
【目的】<br>
 +
MLFバンドを切り出し、そのゲル片からDNAを抽出・精製<br>
 +
<BR>
 +
【実験方法】<br>
 +
ゲルからのDNA抽出<br>
 +
<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
 +
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<br>
 +
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
 +
<tr><td><table border="1" width="230">
 +
<tr><td width="130" align="center">100bp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 μl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">
 +
MLF</td><td align="right">50 μl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">7 μl</td></tr>
 +
</table>
 +
 +
↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
 +
↓EtBrでゲルを40分間染色した<br>
 +
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
 +
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした<br>
 +
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った<br>
 +
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた<br>
 +
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした<br>
 +
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした<br>
 +
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた<br>
 +
↓カラムにサンプルをのせた<br>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた<br>
 +
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした<br>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
 +
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた<br>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
 +
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
 +
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
 +
↓37 μlのMilliQを加えた<br>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
 +
↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をした<br>
 +
<BR>
 +
【結果】<br>
 +
濃度は70 ng/μlだった。<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
トランスフォーメーション<br>
 +
【目的】<br>
 +
MLFのライゲーション産物の増殖<br>
 +
【実験方法】<br>
 +
トランスフォーメーション<br>
 +
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
 +
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した<br>
 +
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
 +
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
 +
↓90 μlのSOC培地を加えた<br>
 +
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
 +
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>
 +
↓37゜Cで一晩インキュベートした。<br>
 +
<br>
 +
【結果】<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
9/21(水)<br>
 +
LBプレート作成<BR>
 +
</p><table border="1" width="170">
 +
<tr><td width="100" align="center">LB培地</td><td width="70" align="right">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align="center">bacto-agar</td><td align="right">15 g/l</td></tr>
 +
</table>
 +
<br>
 +
↓LB培地を作製した<br>
 +
↓1 Lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌した<br>
 +
↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌した<br>
 +
↓65°C程度に冷めたら、必要であれば抗生物質を加えた<br>
 +
↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20~25 ml分注した<br>
 +
↓水平な所に置いて固まらせた<br>
 +
 +
<br>
 +
 +
ライゲーション<br>
 +
【目的】<br>
 +
pSB1C3 vectorとMLFのライゲーション
 +
 +
 +
<br>【実験方法】<br>
 +
<br>
 +
トランスフォーメーション<br>
 +
【目的】<br>
 +
MLFのライゲーション産物の増殖<br>
 +
【実験方法】<br>
 +
トランスフォーメーション<br>
 +
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
 +
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した<br>
 +
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
 +
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
 +
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
 +
↓60 μlのSOC培地を加えた<br>
 +
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
 +
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた<br>
 +
↓37゜Cで一晩インキュベートした<br>
 +
 +
<br>
 +
【結果】<br>
 +
<br>
 +
 +
9/22(木)<br>
 +
ライゲーション<br>
 +
【目的】<br>
 +
pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション<br>
 +
<br>
 +
【実験方法】<br>
 +
<br>
 +
トランスフォーメーション<br>
 +
【目的】<br>
 +
MLFおよびGFPのライゲーション産物の増殖<br>
 +
【実験方法】<br>
 +
トランスフォーメーション<br>
 +
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
 +
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した<br>
 +
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
 +
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
 +
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
 +
↓60 μlのSOC培地を加えた<br>
 +
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
 +
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた<br>
 +
↓37゜Cで一晩インキュベートした<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
 +
9/23<br>
 +
ライゲーション<br>
 +
【目的】<br>
 +
MLFおよびGFPのライゲーション<br>
 +
【実験方法】<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
9/24<br>
 +
プレカルチャー<br>
 +
【目的】
 +
pSB1C3の増殖<br>
 +
【実験方法】<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
9/25<br>
 +
濃度チェック<br>
 +
【目的】
 +
電気泳動によるGFPの濃度測定<br>
 +
【実験方法】<br>
 +
<br>
 +
ライゲーション<br>
 +
【目的】
 +
pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション<br>
 +
【実験方法】<br>
 +
<br>
 +
トランスフォーメーション<br>
 +
【目的】<br>
 +
pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション産物のトランスフォーメーション<br>
 +
【実験方法】<br>
 +
トランスフォーメーション<br>
 +
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
 +
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した<br>
 +
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
 +
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
 +
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
 +
↓60 μlのSOC培地を加えた<br>
 +
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
 +
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>
 +
↓37゜Cで一晩インキュベートした。<br>
 +
<br>
 +
9/26<br>
 +
ゲル抽出<br>
 +
【目的】
 +
MLF,pSB1C3 vectorの精製<br>
 +
【実験方法】
 +
ゲルからのDNA抽出<br>
 +
 +
<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
 +
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<br>
 +
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
 +
 +
<tr><td><table border="1" width="230">
 +
<tr><td width="130" align="center">1 kbp or 100bp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 μl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">
 +
MLF or pSB1C3</td><td align="right">50 μl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">7 μl</td></tr>
 +
</table>
 +
 +
 +
 +
↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
 +
↓EtBrでゲルを40分間染色した<br>
 +
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
 +
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした<br>
 +
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った<br>
 +
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた<br>
 +
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした<br>
 +
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした<br>
 +
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた<br>
 +
↓カラムにサンプルをのせた<br>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた<br>
 +
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした<br>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
 +
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた<br>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
 +
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
 +
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
 +
↓37 μlのMilliQを加えた<br>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
 +
<br>
 +
9/27<br>
 +
ゲル抽出<BR>
 +
【目的】<BR>
 +
制限酵素処理後のpSB1C3の精製<BR>
 +
【実験方法】<BR>
 +
ゲルからのDNA抽出<br>
 +
 +
<a herf="http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/gelpcrsicleanupsystems/qiaquickgelextractionkit.aspx">QIAquick Gel Extraction Kit</a>を使用する<br>
 +
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった<br>
 +
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた<br>
 +
 +
<tr><td><table border="1" width="230">
 +
<tr><td width="130" align="center">1 kbp マーカー</td><td width="100"  align="right">3 μl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">
 +
pSB1C3</td><td align="right">50 μl</td></tr>
 +
<tr><td align="center">Lording Dyi</td><td align="right">7 μl</td></tr>
 +
</table>
 +
 +
 +
 +
↓50 Vで60分間電気泳動した<br>
 +
↓EtBrでゲルを40分間染色した<br>
 +
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した<br>
 +
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした<br>
 +
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った<br>
 +
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた<br>
 +
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした<br>
 +
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした<br>
 +
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた<br>
 +
↓カラムにサンプルをのせた<br>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた<br>
 +
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした<br>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
 +
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた<br>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた<br>
 +
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
 +
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた<br>
 +
↓37 μlのMilliQを加えた<br>
 +
↓10,000 rpmで1分間遠心した<br>
 +
↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をした<BR>
 +
【結果】<BR>
 +
サンプル①の濃度は30 ng/μl  サンプル②の濃度は22 ng/μl  サンプル③の濃度は26 ng/μl<BR>
 +
サンプル④の濃度は24 ng/μl  サンプル⑤の濃度は22 ng/μl  サンプル⑥の濃度は29 ng/μl<BR>
 +
<BR>
 +
ライゲーション<BR>
 +
【目的】<BR>
 +
pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション<BR>
 +
【実験方法】<BR>
 +
↓vector:insert=1:10となるように調製し10 μlにメスアップした<BR>
 +
 +
<br>
 +
<br>
 +
トランスフォーメーション<BR>
 +
【目的】<BR>
 +
MLFおよびGFPのライゲーション産物の増殖<BR>
 +
【実験方法】<BR>
 +
トランスフォーメーション<br>
 +
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
 +
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに50 μlのコンピテント細胞を分注した<br>
 +
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
 +
↓DNAをチューブに5 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
 +
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
 +
↓300 μlのSOC培地を加えた<br>
 +
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
 +
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>
 +
↓37゜Cで一晩インキュベートした。<br>
 +
【結果】<BR>
 +
コロニーが見られなかった<BR>
 +
<BR>
 +
 +
9/28<BR>
 +
制限酵素処理<BR>
 +
【目的】<BR>
 +
pSB1C3の調整<BR>
 +
【実験方法】<BR>
 +
下表に従って、制限酵素処理を行った。<BR>
 +
<BR>
 +
<tr><td><table border=1 width="220px">
 +
<tr><td width="130px" align=center>MilliQ</td><td width="90px"  align=right>6 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>pSB1C3</td><td align=right>20 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center><em>Pst</em>Ⅰ</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center><em>Xba</em>Ⅰ</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x M Buffer</td><td align=right>3 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>&nbsp;</td><td align=right>total 30 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
<br>
 +
<BR>
 +
ライゲーション<BR>
 +
【目的】<BR>
 +
pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション<BR>
 +
【実験方法】<BR>
 +
vector:insert=1:10となるように下記の組成に従って反応液を調整した<BR>
 +
 +
<table border=1 width="200px">
 +
<tr><td width="130px" align=center>insert</td><td width="70px" align=right>0.5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>vector</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x Buffer</td><td align=right>2.5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>F4 ligase</td><td align=right>0.5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>1.0 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 5 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
 +
<BR>
 +
16°C、30minでincubateした<BR>
 +
<br>
 +
トランスフォーメーション<br>
 +
【目的】<br>
 +
pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション産物のトランスフォーメーション<br>
 +
【実験方法】<br>
 +
トランスフォーメーション<br>
 +
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した<br>
 +
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに50 μlのコンピテント細胞を分注した<br>
 +
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した<br>
 +
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした<br>
 +
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた<br>
 +
↓300 μlのSOC培地を加えた<br>
 +
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した<br>
 +
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。<br>
 +
↓37゜Cで一晩インキュベートした。<br>
 +
【結果】<BR>
 +
GFPのコロニーが見られた
 +
 +
 +
 +
<BR>
 +
 +
</p>
 +
</body>
 +
 +
</html>

Latest revision as of 12:42, 2 October 2011

8/29(月)

武田、横井川

制限酵素処理
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(一回目:Xho I)

【実験操作】
PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2~3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした
※保存する場合 ↓-20°Cで保存した

制限酵素処理(Xho I)
下記の組成に従って反応液を調整した

cDNA
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x H Buffer5 µl
Xho1 µl
 total 50 µl
vector
PUAST-flag vector(500 ng/µl)10 µl
ddH2O34 µl
10 x H Buffer5 µl
Xho1 µl
 total 50 µl
37°Cで20時間静置した
8/30(火)
武田、横井川

制限酵素処理
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目:Xho I)
【実験操作】
PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2~3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 μl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした

制限酵素処理(Xba I)


下記の組成に従って反応液を調整した
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x M Buffer5 µl
Xba1 µl
 total 50 µl
vector
PUAST-flag vector(500 ng/µl)10 μl
ddH2O34 µl
10 x H Buffer5 µl
Xho1 µl
 total 50 µl
37°Cで20時間静置した
8/31(水)
武田、横井川
ゲル抽出
【目的】
制限酵素処理したPCR産物・vectorの精製

【実験操作】
ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた
1 kbpマーカー5 µl
DIAP2 or PUAST-flag vector50 µl
Lording Dyi10 µl
↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを10分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 µl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認した
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 µl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 µlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 µlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 µlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 µlを20倍希釈し、濃度測定をした


【結果】
pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375 ng/µlであった。
DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。



9/1(木)
武田

PCR
【目的】
DIAP2のポリメラーゼ連鎖反応

【実験操作】
下記の組成に従って試薬をまぜた
右に示したプログラムで反応を行った
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl or 4 µl
ddH2O33 µl or 31 µl
KOD+ polymelase1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cyle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C100sec
End4°Ckeep 


【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
ゲル電気泳動


ゲル1枚当たりの組成
SeaKemRGTGR-agar0.2 g
1 x TAE20 ml

↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
【結果】
正しい位置にバンドが確認できた


9/5(月)
横井川
制限酵素処理
【目的】
DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(一回目:Xho I)

【実験操作】
PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2~3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした


制限酵素処理(Xho I)
下記の組成に従って反応液を調整した
cDNA
PCR産物 in ddH2O44 μl
10 x H Buffer5 μl
Xho1 μl
 total 50 μl
vector
PUAST-flag vector(500 ng/μl)10 μl
ddH2O34 μl
10 x H Buffer5 μl
Xho1 μl
 total 50 μl
37°Cで20時間静置した

9/6(火)
横井川

制限酵素処理
【目的】
DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(二回目:Xba I)

【実験操作】
PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)
↓PCR産物を400 μlまでddH2Oで薄めた
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 μl加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した
↓水層のみを新しいチューブに移した
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2~3min静置した
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 μl加えた
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した
↓上澄みを捨て、乾燥させた
↓ddH2Oを44 μl加えてvoltexした



制限酵素処理(Xba I)
下記の組成に従って反応液を調整した
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 μl
10 x M Buffer5 μl
Xba1 μl
 total 50 μl
37°Cで20時間静置した

9/7(水)
横井川
ゲル抽出
【目的】
制限酵素処理したDIAP2のPCR産物のゲル抽出

【実験操作】
ゲルからのDNA抽出

QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた
1 kbp マーカー3 μl
DIAP250 μl
Lording Dyi10 μl
↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを10分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した


【結果】
バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。



9/17(土)
制限酵素処理
【目的】
DIAP2のPCR産物の制限酵素処理(二回目:Xba I)

【実験操作】
制限酵素処理(Xba I)
下記の組成に従って反応液を調整した
DIAP2
PCR産物 in ddH2O44 μl
10 x M Buffer5 μl
Xba1 μl
 total 50 μl
37°Cで20時間静置した

9/18(日)
横井川
LB培地
bacto tryptone10 g
bacto yeast evtract5 g
NaCl10 g

↓LB培地用の試薬を計り、ビーカーに入れた
↓950 mlの蒸留水を入れ、スターラーで混ぜて溶かした
↓三角フラスコに分注し、アルミ箔で二重にフタをした
↓121°Cで20分オートクレーブ滅菌した



ゲル抽出
【目的】
制限酵素処理したDIAP2のPCR産物の精製

【実験操作】
ゲルからのDNA抽出

QIAquick Gel Extraction Kitを使用した
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた
1 kbp マーカー3 μl
DIAP250 μl
Lording Dyi10 μl
↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを10分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した



【結果】
バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。



9/20(火)
【目的】
DIAP2のPCR産物の確認

【実験操作】
ゲル電気泳動

ゲル1枚当たりの組成
SeaKemRGTGR-agar0.2 g
1 x TAE20 ml

↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固めた
↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加えた
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れた
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動した
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色した
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせた
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した


ゲル抽出
【目的】
MLFバンドを切り出し、そのゲル片からDNAを抽出・精製

【実験方法】
ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた
100bp マーカー3 μl
MLF50 μl
Lording Dyi7 μl
↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 μlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をした

【結果】
濃度は70 ng/μlだった。


トランスフォーメーション
【目的】
MLFのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓90 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。

【結果】



9/21(水)
LBプレート作成

LB培地 
bacto-agar15 g/l

↓LB培地を作製した
↓1 Lあたり15 gのbacto-agarを入れて、オートクレーブ滅菌した
↓オートクレーブから取り出し、冷めないうちにスターラーで均一になるまで撹拌した
↓65°C程度に冷めたら、必要であれば抗生物質を加えた
↓10 cmのディスポプラスチックシャーレ1枚につき、20~25 ml分注した
↓水平な所に置いて固まらせた

ライゲーション
【目的】
pSB1C3 vectorとMLFのライゲーション
【実験方法】

トランスフォーメーション
【目的】
MLFのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓60 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた
↓37゜Cで一晩インキュベートした

【結果】

9/22(木)
ライゲーション
【目的】
pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション

【実験方法】

トランスフォーメーション
【目的】
MLFおよびGFPのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓60 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた
↓37゜Cで一晩インキュベートした


9/23
ライゲーション
【目的】
MLFおよびGFPのライゲーション
【実験方法】


9/24
プレカルチャー
【目的】 pSB1C3の増殖
【実験方法】


9/25
濃度チェック
【目的】 電気泳動によるGFPの濃度測定
【実験方法】

ライゲーション
【目的】 pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション
【実験方法】

トランスフォーメーション
【目的】
pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション産物のトランスフォーメーション
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに30 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓60 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。

9/26
ゲル抽出
【目的】 MLF,pSB1C3 vectorの精製
【実験方法】 ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた
1 kbp or 100bp マーカー3 μl
MLF or pSB1C350 μl
Lording Dyi7 μl
↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 μlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した

9/27
ゲル抽出
【目的】
制限酵素処理後のpSB1C3の精製
【実験方法】
ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくった
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせた
1 kbp マーカー3 μl
pSB1C350 μl
Lording Dyi7 μl
↓50 Vで60分間電気泳動した
↓EtBrでゲルを40分間染色した
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化した
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだした
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量った
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加えた
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かした
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認すした
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜた
↓カラムにサンプルをのせた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てた
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かした
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てた
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえた
↓37 μlのMilliQを加えた
↓10,000 rpmで1分間遠心した
↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をした
【結果】
サンプル①の濃度は30 ng/μl サンプル②の濃度は22 ng/μl サンプル③の濃度は26 ng/μl
サンプル④の濃度は24 ng/μl サンプル⑤の濃度は22 ng/μl サンプル⑥の濃度は29 ng/μl

ライゲーション
【目的】
pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション
【実験方法】
↓vector:insert=1:10となるように調製し10 μlにメスアップした


トランスフォーメーション
【目的】
MLFおよびGFPのライゲーション産物の増殖
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに50 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに5 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓300 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。
【結果】
コロニーが見られなかった

9/28
制限酵素処理
【目的】
pSB1C3の調整
【実験方法】
下表に従って、制限酵素処理を行った。

MilliQ6 µl
pSB1C320 µl
Pst0.5 µl
Xba0.5 µl
10 x M Buffer3 µl
 total 30 µl


ライゲーション
【目的】
pSB1C3 vectorとMLF、pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション
【実験方法】
vector:insert=1:10となるように下記の組成に従って反応液を調整した
insert0.5 µl
vector0.5 µl
10 x Buffer2.5 µl
F4 ligase0.5 µl
ddH2O1.0 µl
 total 5 µl

16°C、30minでincubateした

トランスフォーメーション
【目的】
pSB1C3 vectorとGFPのライゲーション産物のトランスフォーメーション
【実験方法】
トランスフォーメーション
↓氷上でコンピテント細胞(DH5 Alpha:大腸菌株)を解凍した
↓前もって冷やしておいた1.5 mlチューブに50 μlのコンピテント細胞を分注した
↓余ったコンピテント細胞は-80°Cの冷凍庫に戻した
↓DNAをチューブに3 μl加えて、氷上で30分間冷やした
↓42°Cで45秒間熱ショックを与えた
↓300 μlのSOC培地を加えた
↓37°Cで1時間、振りながら回復培養した
↓LBプレート(+chloramphenicol)にまいた。
↓37゜Cで一晩インキュベートした。
【結果】
GFPのコロニーが見られた