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Team:KIT-Kyoto/yokoigawa
From 2011.igem.org
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| + | <p>9/17（土）<br> | ||
| + | <span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-font-family: 'ＭＳ 明朝'; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin">【目的】<br> | ||
| + | </span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA" lang="EN-US">PCR</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">産物</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">の制限酵素処理</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA" lang="EN-US">(</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">二回目：</span><span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ Ｐゴシック'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA" lang="EN-US">Xba I)<br> | ||
| + | <span style="FONT-FAMILY: 'ＭＳ 明朝','serif'; FONT-SIZE: 12pt; mso-bidi-font-family: 'ＭＳ Ｐゴシック'; mso-font-kerning: 0pt; mso-ascii-font-family: Century; mso-ascii-theme-font: minor-latin; mso-fareast-theme-font: minor-fareast; mso-hansi-font-family: Century; mso-hansi-theme-font: minor-latin; mso-ansi-language: EN-US; mso-fareast-language: JA; mso-bidi-language: AR-SA">【実験操作】<br> | ||
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| + | <strong>制限酵素処理(Xba | ||
| + | I)</strong><br> | ||
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| + | 下記の組成に従って反応液を調整する<br> | ||
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| + | <tr><td width?150px? align="center">PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width?50px? align="right">44 μl</td></tr> | ||
| + | <tr><td align="center">10 x M Buffer</td><td align="right">5 μl</td></tr> | ||
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| + | <tr><td> </td><td align="right">total 50 μl</td></tr> | ||
| + | </table></td></tr></table>37°Cで20時間静置する | ||
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Revision as of 11:42, 25 September 2011
8/29(月)
武田、横井川
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho I）
【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400
µlまでddH2Oで薄める
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400
µl加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓3M
CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100%
ethanolを3倍量加えて、2～3min静置する
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する
↓上澄みを捨て、70%
ethanol(EtOH)を200
µl加える
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する
↓上澄みを捨て、乾燥させる
↓ddH2Oを44
µl加えてvoltexする
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する
制限酵素処理(Xho
I)
下記の組成に従って反応液を調整する下記の組成に従って反応液を調整する
|
|
8/30(火)
武田、横井川
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目：Xba I)
【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400
µlまでddH2Oで薄める
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400
µl加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓3M
CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100%
ethanolを3倍量加えて、2～3min静置する
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する
↓上澄みを捨て、70%
ethanol(EtOH)を200
µl加える
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する
↓上澄みを捨て、乾燥させる
↓ddH2Oを44
µl加えてvoltexする
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する
制限酵素処理(Xba
I)
下記の組成に従って反応液を調整する
| |||||||||
| vector |
| PUAST-flag vector(500 ng/μl) | 10 μl |
| ddH2O | 34 μl |
| 10 x H Buffer | 5 μl |
| XhoⅠ | 1 μl |
| total 50 μl |
8/31(水)
武田、横井川
【目的】
制限酵素処理したPCR産物・vectorのゲル抽出
【実験操作】
ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせる
| 1 kbpマーカー | 5 ml |
| DIAP2 or PUAST-flag vector | 50 ml |
| Lording Dyi | 10 ml |
↓EtBrでゲルを10分間染色する
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する
↓清潔で鋭利な手術用メスでゲルからDNA断片を切りだす
↓1.5 mlチューブ中のゲルスライスの重さを量る
↓ゲル100 mgに対して、3倍量(300 μl)のBuffer QGを加える
↓42-50°Cで10分間放置し、ゲルを完全に溶かす
↓ゲルが完全に溶けたら、溶液が黄色であることを確認する
↓ゲル100 mgに対して、当量(100 μl)の2-プロパノールを加え、混ぜる
↓カラムにサンプルをのせる
↓10,000 rpmで1分間遠心し、抽出物を捨てる
↓500 μlのBuffer QGをカラムに加え、残りのゲルを溶かす
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓750 μlのwash Buffer PEをカラムに加える
↓10,000 rpmで1分間遠心し、ろ液を捨てる
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓カラムを新しい1.5 mlチューブに移しかえる
↓37 μlのMilliQを加える
↓10,000 rpmで1分間遠心する
↓そのうち5 μlを20倍希釈し、濃度測定をする
【結果】
pUAST-flag vectorは精製でき、濃度は45.0375ng/μlであった。
DIAP2はゲル抽出でバンドが見られなかった。
9/1(木)
武田
【目的】
DIAP2のポリメラーゼ連鎖反応
【実験操作】
右に示したプログラムで反応を行う
|
|
PCR産物の確認
【実験操作】
ゲル電気泳動
ゲル1枚当たりの組成| SeaKemRGTGR-agar | 0.2 g |
| 1 x TAE | 20 ml |
↓上記の組成に従い、試薬を三角フラスコで混ぜてレンジで加熱し、専用容器に入れて固める
↓制限酵素処理した反応液50 μlに対して6 x loading dye を10 μl加える
↓サンプルとDNA maker をコーム穴に入れる
↓サンプルをセット後、50 V 60minで電気泳動する
↓電気泳動後、EtBrで10minゲルを染色する
↓染色後、MilliQでゲルを数回洗ってプレートにのせる
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する
9/5(月)
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理（一回目：Xho I）
【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400
µlまでddH2Oで薄める
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400
µl加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓3M
CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100%
ethanolを3倍量加えて、2～3min静置する
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する
↓上澄みを捨て、70%
ethanol(EtOH)を200
µl加える
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する
↓上澄みを捨て、乾燥させる
↓ddH2Oを44
µl加えてvoltexする
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する
制限酵素処理(Xho
I)
下記の組成に従って反応液を調整する下記の組成に従って反応液を調整する
|
|
9/6(火)
【目的】
PCR産物とpUAST-flag vectorの制限酵素処理(二回目：Xba I)
【実験操作】
PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
↓PCR産物を400
µlまでddH2Oで薄める
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400
µl加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexする
↓10000rpm、4°Cで2～3min遠心する
↓水層のみを新しいチューブに移す
↓3M
CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100%
ethanolを3倍量加えて、2～3min静置する
↓15000rpm、4°Cで10min遠心する
↓上澄みを捨て、70%
ethanol(EtOH)を200
µl加える
↓15000rpm、4°Cで5min遠心する
↓上澄みを捨て、乾燥させる
↓ddH2Oを44
µl加えてvoltexする
※保存する場合 ↓-20°Cで保存する
制限酵素処理(Xba
I)
下記の組成に従って反応液を調整する
|
9/7(水)
横井川
【目的】
制限酵素処理したPCR産物・vectorのゲル抽出
【実験操作】
ゲルからのDNA抽出
QIAquick Gel Extraction Kitを使用する
↓1 x TAEに溶かしたアガロースゲルをつくる
↓DNAとLording Dyeをまぜたものとマーカーをゲルにのせる
| 1 kbp or 100bp マーカー | 3 ml |
| DIAP2 | 50 ml |
| Lording Dyi | 10 ml |
↓EtBrでゲルを10分間染色する
↓UVを照射してDNAのバンドを可視化する
【結果】
バンドが確認できなかったためゲル抽出を行う事が出来なかった。
9/17（土）
【目的】
PCR産物の制限酵素処理(二回目：Xba I)
【実験操作】
制限酵素処理(Xba
I)
下記の組成に従って反応液を調整する
|
