Team:KIT-Kyoto/matsunami

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8月8日(月)

松浪、横井川

【目的】
 cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
 (1)PCR反応液の調製
*DIAP2

PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
鋳型 DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
dNTPs(2.0 µM)2 µl
ddH2O14.1 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
 全量 20 µl
Cycle条件
Start94°C、2分
Cycle x 3094°C、15秒(熱変性)
56.9°C、30秒(アニーリング)
72°C、100秒(伸長)
End4°Cで保持

*API2-MALT1
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
鋳型 DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
dNTPs(2.0 µM)2 µl
ddH2O14.1 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
 全量 20 µl
Cycle条件
Start94°C、2分
Cycle x 3094°C、15秒(熱変性)
51.5°C、30秒(アニーリング)
72°C、3分20秒(伸長)
End4°Cで保持
上記の分量を混合した。

*<プライマーの塩基配列>
・DIAP2
F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値 69゜C
R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値 66.4゜C
増幅サイズ  約1514 bp

・API2-MALT1
F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT Tm値 57.8゜C
R primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値 56.5゜C
増幅サイズ  約3131 bp




8月9日(火)

松浪、横井川

【目的】
 PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液 2 µl
milliQ 8 µl
6 x loading dye 2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。


【目的】
 pUAST溶液の形質転換

【実験操作】
 pUAST 1 µLとコンピテントセルを混合した。
 ↓これを氷上で15分間放置した。
 ↓43℃で30秒間温め、氷上で10分間放置した。
 これをLBプレートに塗り37℃でincubateした。



8月10日(水)

松浪

【目的】
 cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
 8月8日と同様である。


【目的】
 大腸菌の培養

【実験操作】
 ガスバーナーで加熱滅菌したつまようじでLB(amp+)プレートから生えてきた大腸菌のコロニーをついた。
 ↓ついた先端を2個のLB培地(amp+)2mLに攪拌した。
 pUASTとコンピテントセルの混合物を10 µL、100 µLをそれぞれまいた。


8月11日(木)

松浪

【目的】
 pUAST flag vectorの大量精製

【実験操作】
 培養液1.5 mLを、15000rpm、5分、4℃の条件で遠心した。この間にglucose solution、5M K-acetate pH 4.8を氷上で冷やした。
 ↓5分後、上清を廃棄しglucose solution 100 µL加えて攪拌した。
 ↓沈殿物を溶解した後、0.2N NaOH 1% SDS 200 µLを加えてよく混ぜ、氷上に5分間放置した。
 ↓5分後、5M K-acetate pH 4.8 150 µLを加えてよく混ぜ、氷上に5分間放置した。
 ↓5分後、15000rpm、10分、4℃の条件で遠心した。
 ↓上清を新しいチューブに移し、isopropanolを等量入れ攪拌し3分間静置した。
 ↓3分後、15000rpm、10分、25℃の条件で遠心した。
 ↓遠心後、上清を廃棄し70% EtOH 200 µLを加えて軽く攪拌し3分間静置した。その後、15000rpm、10分、25℃の条件で再び遠心した。
 遠心後、上清を廃棄し乾燥させてRnase in TE 20 µLを加えた。
 
【目的】
 PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液       2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。



8月12日(金)

松浪、横井川

【目的】
 pUAST flag vectorの大量精製

【実験操作】
 培養した大腸菌をオートクレーブした遠心管で4000G、10分、25℃の条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
 ↓R3 with RNase A4 を4 mL加えて、攪拌し完全に溶解させた。
 ↓L7を4 mLを加え丁寧に混合し5分間室温で静置した。
 ↓5分後、N3を4 mL加えてすぐに混ぜた。これを12000G、10分、25℃の条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
 ↓事前にEQ1 10 mLを加えて平衡化していたカラムに上清をLoadし、上清が流れ落ちるのを待った。このとき、一部をチューブに保存した。
 ↓Wash Buffer (W8) 10 mLを加えて洗浄した。これを2回行った。
 ↓Elution buffer (E4)を5 mL加えてDNAを溶出させた。追加で、E4 2 mLをLoadし、別のチューブに保存した。
 ↓isopropanol 3.5 mLを加えて混合し、これを15000G、40分、4℃の条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
 ↓70% EtOH 3mLを加えて再懸濁し、15000G、5分、4℃の条件で再び遠心し、遠心後上清を捨てた。
 Air-dryで乾燥させ200 µLでのTEに溶かした。

 次にこの溶液のDNA濃度測定を行った。
 milliQ 100 µLおよび、精製したDNA溶液を100倍希釈した溶液を準備した。
 ↓milliQ 100 µLでゼロ補正を行い、サンプル1、5の吸光度を測定した。結果を以下に示す(表1)。
                表1、サンプル1、5の吸光度の値
 
 サンプル1
 0.189  0.208 0.192  0.190  0.191 
平均は0.194であった。
これより、サンプル1のDNA濃度は0.970 µg/µLであった。

サンプル5
 0.282 0.276  0.278  0.269  0.269 
平均は0.275でった。
これより、サンプル5のDNA濃度は1.37 µg/µLであった。

【目的】
 PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液       2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。


8月15日(月)

松浪、横井川

【目的】
 cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
 8月8日と同じであるが、Annealing について以下のように変更した。
 DIAP2             56.9℃
 API2-MALT1      53℃

【目的】
 PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液       2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。


8月16日(火)

松浪

【目的】
 cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
 8月8日と同じであるが、Annealing について以下のように変更した。
 DIAP2                 58.9℃
 API2-MALT1             53℃

【目的】
 PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液       2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。



8月17日(水)

松浪、横井川


【目的】
 cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
 8月8日と同じであるが、Annealing について以下のように変更した。
 DIAP2              50.5℃
 API2-MALT1        53.5℃

【目的】
 PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液       2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。





 


   


8/23(火)

松浪

【目的】
 cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
 (1)PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
   KOD+ polymelase           1 µL
       10 x Buffer                           2 µL      
       dNTP(2.0 µM)                         5 µL
       F primer(10 µM)                    1.5 µL
       R primer(10 µM)                    1.5 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                   33 µL
       
       上記の分量を混合した。
   
                  
 
  (2)PCR反応条件
   <1>×1   Pre-denature    94 ℃   2 min

       <2>×35  Denature          94 ℃    15 sec
          
       ・DIAP2
                       Annealing        50.5 ℃     30 sec
                       Extension          68 ℃       1 min 40 sec
               ・API2-MALT1
           Annealing              ℃     30 sec
                       Extension          68 ℃       3 min


       <3>                                   72℃    10 min
       <4>                                     4℃        ∞
                       

        上記の条件でPCRを行った。

【目的】
 PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液       2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。



8月24日(水)

松浪

【目的】
 cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
 (1)PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
   Takara Ex Taq          0.1 µL
       10 x Ex Taq Buffer                 2 µL      
       dNTP(2.0 µM)                         2 µL
       F primer                              0.4 µL
       R primer                              0.4 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                 14.1 µL
       
       上記の分量を混合した。
   ただし、10倍希釈、100倍希釈したAPI2-MALT1のTemplet DNAを用いた。
 
  (2)PCR反応条件
   <1>×1   Pre-denature    94 ℃   2 min

       <2>×37  Denature          94 ℃    15 sec
                       Annealing        51.5 ℃     30 sec
                       Extension          72 ℃       3 min  20 sec


        上記の条件でPCRを行った。

【目的】
 PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液       2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。


8月25日(木)

松浪

【目的】
 cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
  ・API2-MALT1
  (1)PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
   Takara Ex Taq          0.1 µL
       10 x Ex Taq Buffer                 2 µL      
       dNTP(2.0 µM)                         2 µL
       F primer                              0.4 µL
       R primer                              0.4 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                 14.1 µL
       
       上記の分量を混合した。
    
  (2)PCR反応条件
   <1>×1   Pre-denature    94 ℃   2 min

       <2>×37  Denature          94 ℃    15 sec
                       Annealing        51.5 ℃     30 sec
                       Extension          72 ℃       3 min  20 sec

    ・DIAP2
 (1)PCR反応液の調製()
       <1本分あたり>
   KOD+ polymelase           1 µL
       10 x Buffer                           2 µL      
       dNTP(2.0 µM)                         5 µL
       F primer(10 µM)                    1.5 µL
       R primer(10 µM)                    1.5 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                   33 µL
       
       上記の分量を混合した。
                  
 
  (2)PCR反応条件
   <1>×1   Pre-denature    94 ℃   2 min

       <2>×35  Denature          94 ℃    15 sec
                       Annealing        50.5 ℃     30 sec
                       Extension          68 ℃       1 min 40 sec

       <3>                                   4℃        ∞
                       

        上記の条件でPCRを行った。


【目的】
 PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液       2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。







9月12日(月)

松浪、横井川

【目的】
 cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
 (1)PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
   KOD+ polymelase           1 µL
       10 x Buffer                           2 µL      
       dNTP(2.0 µM)                         5 µL
       F primer(10 µM)                    1.5 µL
       R primer(10 µM)                    1.5 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                   33 µL
       
       上記の分量を混合した。
   
   *<プライマーの塩基配列>
     ・DIAP2
              F primer  :                                                             Tm値
                 GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT    62 ℃
       R primer  :
                 GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA           66.4 ℃
      増幅サイズ  約1514 bp

               
 
  (2)PCR反応条件
   <1>×1   Pre-denature    94 ℃   2 min

       <2>×35  Denature          94 ℃    15 sec
                       Annealing        50.5 ℃     30 sec
                       Extension          68 ℃       1 min 40 sec

       <3>                                   4℃        ∞
                       

        上記の条件でPCRを行った。



9月13日(火)

松浪、横井川

【目的】
 PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液       2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。



9月14日(水)

松浪、横井川

【目的】
 cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
 (1)PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
   Takara Ex Taq          0.1 µL
       10 x Ex Taq Buffer                 2 µL      
       dNTP(2.0 µM)                         2 µL
       F primer                              0.4 µL
       R primer                              0.4 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                 14.1 µL
       
       上記の分量を混合した。
   
   *<プライマーの塩基配列>   
    ・API2-MALT1
              F primer  :                                                             Tm値
                 GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT            57.8 ℃
              R primer
                 GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA              56.5 ℃
              増幅サイズ  約3131 bp
    
 
  (2)PCR反応条件
   <1>×1   Pre-denature    94 ℃   2 min

       <2>×37  Denature          94 ℃    15 sec
                      Annealing        51.5 ℃     30 sec
                       Extension          72 ℃       3 min  20 sec


        上記の条件でPCRを行った。



【目的】
 PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液       2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。


9月15日(木)

松浪、横井川

【目的】
 cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
 (1)PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
   KOD+ polymelase           1 µL
       10 x Buffer                           2 µL      
       dNTP(2.0 µM)                         5 µL
       F primer(10 µM)                    1.5 µL
       R primer(10 µM)                    1.5 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                   33 µL
       
       上記の分量を混合した。
   
   *<プライマーの塩基配列>
     ・DIAP2
              F primer  :                                                             Tm値
                 GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT    62 ℃
       R primer  :
                 GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA           66.4 ℃
      増幅サイズ  約1514 bp

               
 
  (2)PCR反応条件
   <1>×1   Pre-denature    94 ℃   2 min

       <2>×35  Denature          94 ℃    15 sec
                       Annealing        50.5 ℃     30 sec
                       Extension          68 ℃       1 min 40 sec

       <3>                                   4℃        ∞
                       

        上記の条件でPCRを行った。


【目的】
 PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液       2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
 泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。


【目的】
 PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
 (1)PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)
   PCR産物を400 µLまでmilliQで薄め、フェノールクロロホルムを400 µL加えて攪拌した。
   ↓10000 rpm、3 min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。
   ↓クロロホルムを等量加えて攪拌した。
   ↓10000 rpm、3 min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。
   ↓3 M  酢酸ナトリウム(pH 5.27)を1/10量加え、イソプロパノールを等量加え、3 min静置した。
   ↓14000 rpm、10 min、4℃で遠心後、上清を捨て70%エタノールを200 µL加えた。
   ↓15000 rpm、5 min、4℃で遠心後、上清を捨て乾燥させた。
   ↓乾燥後、milliQ44 µLを加えて攪拌した。
   この溶液にXhoIを1 µL、10×H Bufferを5 µLを加え、37℃で20時間静置した。



9月16日(金)

松浪、横井川

【目的】
 PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
 (1)PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)
   PCR産物を400 µLまでmilliQで薄め、フェノールクロロホルムを400 µL加えて攪拌した。
   ↓10000 rpm、3 min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。
   ↓クロロホルムを等量加えて攪拌した。
   ↓10000 rpm、3 min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。
   ↓3 M  酢酸ナトリウム(pH 5.27)を1/10量加え、イソプロパノールを等量加え、3 min静置した。
   ↓14000 rpm、10 min、4℃で遠心後、上清を捨て70%エタノールを200 µL加えた。
   ↓15000 rpm、5 min、4℃で遠心後、上清を捨て乾燥させた。
   乾燥後、TE44 µLを加えて攪拌し-20℃で保存した。