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Team:KIT-Kyoto/matsunami
From 2011.igem.org
あいうえお
さささ
ささｓｓｓ
あああああ
ＴＥ
50μＬ
1000
8月8日（月）
松浪、横井川
【目的】
cDNA
vectorを鋳型としたcDNAの増殖
【実験操作】
（1）PCR反応液の調製
<1本分あたり>
Takara Ex Taq 0.1
µL
10
x Ex Taq Buffer
2
µL
dNTP(2.0 µM)
2
µL
F
primer
0.4
µL
R primer
0.4
µL
Templet
DNA
1
µL
milliQ 14.1
µL
上記の分量を混合した。
＊<プライマーの塩基配列>
・DIAP2
F
primer :
Tm値
GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT 69
℃
R primer
:
GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
66.4
℃
増幅サイズ 約1514
bp
・API2-MALT1
F
primer :
Tm値
GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
57.8
℃
R
primer
GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
56.5
℃
増幅サイズ 約3131
bp
(2)PCR反応条件
<1>×1 Pre-denature
94 ℃ 2
min
<2>×37 Denature
94 ℃ 15
sec
(DIAP2)
Annealing
56.9
℃ 30
sec
Extension 72
℃
1
min
40
sec
(API2-MALT1)
Annealing
51.5
℃
30
sec
Extension 72
℃
3
min
20
sec
上記の条件でPCRを行った。
8月9日（火）
松浪、横井川
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
PCR反応液 2 µL
milliQ
8 µL
6 x loading dye 2
µL
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100
V、30分の条件で電気泳動した。
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。
【目的】
pUAST溶液の形質転換
【実験操作】
pUAST 1 µLとコンピテントセルを混合した。
↓これを氷上で15分間放置した。
↓43℃で30秒間温め、氷上で10分間放置した。
これをLBプレートに塗り37℃でincubateした。
8月10日（水）
松浪
【目的】
cDNA
vectorを鋳型としたcDNAの増殖
【実験操作】
8月8日と同様である。
【目的】
大腸菌の培養
【実験操作】
ガスバーナーで加熱滅菌したつまようじでLB（amp+）プレートから生えてきた大腸菌のコロニーをついた。
↓ついた先端を2個のLB培地（amp+）2mLに攪拌した。
pUASTとコンピテントセルの混合物を10 µL、100
µLをそれぞれまいた。
8月11日（木）
松浪
【目的】
pUAST flag
vectorの大量精製
【実験操作】
培養液1.5 mLを、15000rpm、5分、4℃の条件で遠心した。この間にglucose
solution、5M K-acetate pH 4.8を氷上で冷やした。
↓5分後、上清を廃棄しglucose solution 100
µL加えて攪拌した。
↓沈殿物を溶解した後、0.2N NaOH 1% SDS 200
µLを加えてよく混ぜ、氷上に5分間放置した。
↓5分後、5M K-acetate pH 4.8 150
µLを加えてよく混ぜ、氷上に5分間放置した。
↓5分後、15000rpm、10分、4℃の条件で遠心した。
↓上清を新しいチューブに移し、isopropanolを等量入れ攪拌し3分間静置した。
↓3分後、15000rpm、10分、25℃の条件で遠心した。
↓遠心後、上清を廃棄し70%
EtOH 200
µLを加えて軽く攪拌し3分間静置した。その後、15000rpm、10分、25℃の条件で再び遠心した。
遠心後、上清を廃棄し乾燥させてRnase in
TE 20
µLを加えた。
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
PCR反応液
2 µL
milliQ
8 µL
6 x loading dye 2
µL
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100
V、30分の条件で電気泳動した。
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。
8月12日（金）
松浪、横井川
【目的】
pUAST
flag
vectorの大量精製
【実験操作】
培養した大腸菌をオートクレーブした遠心管で4000G、10分、25℃の条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
↓R3
with RNase A4 を4 mL加えて、攪拌し完全に溶解させた。
↓L7を4
mLを加え丁寧に混合し5分間室温で静置した。
↓5分後、N3を4
mL加えてすぐに混ぜた。これを12000G、10分、25℃の条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
↓事前にEQ1 10
mLを加えて平衡化していたカラムに上清をLoadし、上清が流れ落ちるのを待った。このとき、一部をチューブに保存した。
↓Wash Buffer (W8)
10 mLを加えて洗浄した。これを2回行った。
↓Elution buffer (E4)を5 mL加えてDNAを溶出させた。追加で、E4 2
mLをLoadし、別のチューブに保存した。
↓isopropanol 3.5
mLを加えて混合し、これを15000G、40分、4℃の条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
↓70% EtOH
3mLを加えて再懸濁し、15000G、5分、4℃の条件で再び遠心し、遠心後上清を捨てた。
Air-dryで乾燥させ200
µLでのTEに溶かした。
次にこの溶液のDNA濃度測定を行った。
milliQ 100
µLおよび、精製したDNA溶液を100倍希釈した溶液を準備した。
↓milliQ 100
µLでゼロ補正を行い、サンプル1、5の吸光度を測定した。結果を以下に示す（表1）。
表1、サンプル1、5の吸光度の値
サンプル1
| 0.189 | 0.208 | 0.192 | 0.190 | 0.191 |
これより、サンプル1のDNA濃度は0.970 µg/µLであった。
サンプル5
| 0.282 | 0.276 | 0.278 | 0.269 | 0.269 |
これより、サンプル5のDNA濃度は1.37 µg/µLであった。
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
PCR反応液 2 µL
milliQ 8 µL
6 x loading dye 2 µL
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。
8月15日（月）
松浪、横井川
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認
【実験操作】
8月8日と同じであるが、Annealing について以下のように変更した。
DIAP2 56.9℃
API2-MALT1 53℃
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
PCR反応液 2 µL
milliQ 8 µL
6 x loading dye 2 µL
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。
8月16日（火）
松浪
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認
【実験操作】
8月8日と同じであるが、Annealing について以下のように変更した。
DIAP2 58.9℃
API2-MALT1 53℃
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
PCR反応液 2 µL
milliQ 8 µL
6 x loading dye 2 µL
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。
8月17日（水）
松浪、横井川
【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認
【実験操作】
8月8日と同じであるが、Annealing について以下のように変更した。
DIAP2 50.5℃
API2-MALT1 53.5℃
【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
PCR反応液 2 µL
milliQ 8 µL
6 x loading dye 2 µL
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。
