Team:KIT-Kyoto/matsunami

From 2011.igem.org

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<BR>
-
下記の組成に従って試薬をまぜる<br>
+
下記の組成に従って試薬をまぜた。<br>
-
右に示したプログラムで反応を行う<br>
+
右に示したプログラムで反応を行った。<br>
<br>
<br>
*&lt;プライマーの塩基配列&gt;<br>
*&lt;プライマーの塩基配列&gt;<br>
Line 139: Line 139:
<BR>
<BR>
-
下記の組成に従って試薬をまぜる<br>
+
下記の組成に従って試薬をまぜた。<br>
-
右に示したプログラムで反応を行う<br>
+
右に示したプログラムで反応を行った。<br>
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
Line 253: Line 253:
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認<br>
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認<br>
<br>
<br>
-
【実験操作】
+
【実験操作】<br>
 +
・API2-MALT1<br>
<table border="0"><tr><td>
<table border="0"><tr><td>
<table border="0" width="150px">
<table border="0" width="150px">
Line 275: Line 276:
<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
-
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>(Tm-5)°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
+
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>58.9°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
Line 282: Line 283:
</td></tr>
</td></tr>
</table>
</table>
 +
<br>
 +
・DIAP2<br>
 +
<table border="0"><tr><td>
 +
<table border="0" width="150px">
 +
<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="220px">
 +
<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</td><TD></TD><TD></TD><td>
 +
<table border="0" width="100px">
 +
<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="400px">
 +
<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
 +
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
</table>
 +
</td></tr>
 +
</table>
 +
 +
<BR>
<BR>
-
下記の組成に従って試薬をまぜる<br>
+
下記の組成に従って試薬をまぜた。<br>
-
右に示したプログラムで反応を行う<br>
+
右に示したプログラムで反応を行った。<br>
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
Line 310: Line 343:
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認<br>
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認<br>
<br>
<br>
-
【実験操作】<font color=red>←実験操作を書く。ぷろとこるのテーブルをコピペする!!</font><br>
+
【実験操作】<br>
-
8月8日と同じであるが、Annealingについて以下のように変更した。<br>
+
・API2-MALT1<br>
-
DIAP2&nbsp;&nbsp;&nbsp;  
+
<table border="0"><tr><td>
-
   &nbsp;&nbsp;  
+
<table border="0" width="150px">
-
    
+
<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
-
58.9℃<br>
+
</table>
-
API2-MALT1&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;  
+
<table border=1 width="220px">
-
     53℃<br>
+
<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</td><TD></TD><TD></TD><td>
 +
<table border="0" width="100px">
 +
<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="400px">
 +
<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
 +
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
</table>
 +
</td></tr>
 +
</table>
 +
 
 +
・DIAP2<br>
 +
<table border="0"><tr><td>
 +
<table border="0" width="150px">
 +
<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="220px">
 +
<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</td><TD></TD><TD></TD><td>
 +
<table border="0" width="100px">
 +
<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="400px">
 +
<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>58.9°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
 +
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
</table>
 +
</td></tr>
 +
</table>
 +
 
 +
 
 +
 
 +
 
 +
 
 +
 
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
Line 343: Line 434:
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認<br>
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認<br>
<br>
<br>
-
【実験操作】<font color=red>←実験操作を書く。ぷろとこるのテーブルをコピペする!!</font><br>
+
【実験操作】<br>
-
8月8日と同じであるが、Annealing&nbsp;について以下のように変更した。<br>
+
・API2-MALT1<br>
-
DIAP2    &nbsp;&nbsp;  
+
<table border="0"><tr><td>
-
    
+
<table border="0" width="150px">
-
50.5℃<br>
+
<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
-
API2-MALT1       
+
</table>
-
53.5℃<br>
+
<table border=1 width="220px">
-
<br>
+
<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</td><TD></TD><TD></TD><td>
 +
<table border="0" width="100px">
 +
<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="400px">
 +
<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>53.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
 +
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
</table>
 +
</td></tr>
 +
</table>
 +
 
 +
・DIAP2<br>
 +
<table border="0"><tr><td>
 +
<table border="0" width="150px">
 +
<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="220px">
 +
<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</td><TD></TD><TD></TD><td>
 +
<table border="0" width="100px">
 +
<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="400px">
 +
<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>50.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
 +
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
 +
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
 +
</table>
 +
</td></tr>
 +
</table>
 +
 
 +
 
 +
 
 +
 
【目的】<br>
【目的】<br>
 PCR産物の確認<br>
 PCR産物の確認<br>
Line 468: Line 615:
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
<br>
<br>
-
【実験操作】<font color=red>←ぷろとこるのテーブルをコピペする!!</font><br>
+
【実験操作】<br>
-
 (1)PCR反応液の調製<br>
+
・API2-MALT1<br>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<table border="0"><tr><td>
-
&lt;1本分あたり&gt;<br>
+
<table border="0" width="150px">
-
   Takara&nbsp;Ex&nbsp;Taq          0.1  
+
<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
-
&micro;L<br>
+
</table>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 10 x Ex Taq
+
<table border=1 width="220px">
-
Buffer &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
-
2 &micro;L      <br>
+
<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; dNTP(2.0
+
<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
-
&micro;M)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
-
2 &micro;L<br>
+
<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;F
+
<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
-
primer&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
-
0.4 &micro;L<br>
+
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; R  
+
</table>
-
primer&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
</td><TD></TD><TD></TD><td>
-
0.4  
+
<table border="0" width="100px">
-
&micro;L&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
+
<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
</table>
-
Templet
+
<table border=1 width="400px">
-
DNA&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
-
1 &micro;L<br>
+
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-
milliQ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;14.1  
+
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
-
&micro;L<br>
+
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
+
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
</table>
-
上記の分量を混合した。<br>
+
</td></tr>
-
   ただし、10倍希釈、100倍希釈したAPI2-MALT1のTemplet DNAを用いた。<br>
+
</table>
-
&nbsp;<br>
+
 
-
 
+
鋳型DNAを10、100倍希釈後、上記の条件でPCRを行った。<br>
-
(2)PCR反応条件<br>
+
-
   &lt;1&gt;×1   Pre-denature&nbsp;   94 ℃   2
+
-
min<br>
+
-
<br>
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
&lt;2&gt;×37  Denature&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;   94 ℃  &nbsp;
+
-
15
+
-
sec<br>
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;Annealing&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
51.5 ℃  &nbsp;&nbsp; 30
+
-
sec<br>
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
Extension&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 72
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 3 min&nbsp; 20
+
-
sec<br>
+
-
<br>
+
-
<br>
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
上記の条件でPCRを行った。<br>
+
<br>
<br>
【目的】<br>
【目的】<br>
Line 542: Line 670:
<br>
<br>
【実験操作】<font color=red>←ぷろとこるのテーブルをコピペする!!</font><br>
【実験操作】<font color=red>←ぷろとこるのテーブルをコピペする!!</font><br>
-
  ・API2-MALT1<br>
+
・API2-MALT1<br>
-
&nbsp;
+
<table border="0"><tr><td>
-
(1)PCR反応液の調製<br>
+
<table border="0" width="150px">
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
-
&lt;1本分あたり&gt;<br>
+
</table>
-
   Takara&nbsp;Ex&nbsp;Taq          0.1  
+
<table border=1 width="220px">
-
&micro;L<br>
+
<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 10 x Ex Taq
+
<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
-
Buffer &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
-
2 &micro;L      <br>
+
<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; dNTP(2.0
+
<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
-
&micro;M)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
-
2 &micro;L<br>
+
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;F
+
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
-
primer&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
</table>
-
0.4 &micro;L<br>
+
</td><TD></TD><TD></TD><td>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; R  
+
<table border="0" width="100px">
-
primer&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
-
0.4  
+
</table>
-
&micro;L&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
+
<table border=1 width="400px">
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
-
Templet
+
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
-
DNA&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-
1 &micro;L<br>
+
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
-
milliQ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;14.1  
+
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
-
&micro;L<br>
+
</table>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
+
</td></tr>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
</table>
-
上記の分量を混合した。<br>
+
 
-
   &nbsp;<br>
+
-
  (2)PCR反応条件<br>
+
-
   &lt;1&gt;×1   Pre-denature&nbsp;  
+
-
  94 ℃   2 min<br>
+
-
<br>
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
&lt;2&gt;×37  Denature&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;   94 ℃  &nbsp;
+
-
15
+
-
sec<br>
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;Annealing&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
51.5 ℃  &nbsp;&nbsp; 30
+
-
sec<br>
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
Extension&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 72
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 3 min&nbsp; 20
+
-
sec<br>
+
<br>
<br>
&nbsp;&nbsp;&nbsp;  
&nbsp;&nbsp;&nbsp;  
Line 773: Line 885:
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
<br>
<br>
-
【実験操作】<font color=red>←ぷろとこるのテーブルをコピペする!!</font><br>
+
【実験操作】<br>
-
 (1)PCR反応液の調製<br>
+
<table border="0"><tr><td>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<table border="0" width="150px">
-
&lt;1本分あたり&gt;<br>
+
<tr><td align=center>PCR条件</td></tr>
-
   Takara&nbsp;Ex&nbsp;Taq          0.1
+
</table>
-
&micro;L<br>
+
<table border=1 width="220px">
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 10 x Ex Taq  
+
<tr><td width="150px" align=center>10 µM Primer F</td><td width="70px"  align=right>0.4 µl</td></tr>
-
Buffer &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<tr><td align=center>10 µM Primer R</td><td align=right>0.4 µl</td></tr>
-
2 &micro;L      <br>
+
<tr><td align=center>Template DNA</td><td align=right>1 µl</td></tr>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; dNTP(2.0
+
<tr><td align=center>10 x Ex Taq Buffer</td><td align=right>2 µl</td></tr>
-
&micro;M)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;  
+
<tr><td align=center>Takara Ex Taq</td><td align=right>0.1 µl</td></tr>
-
2 &micro;L<br>
+
<tr><td align=center>2.0 mM dNTPs</td><td align=right>2 µl</td></tr>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;F
+
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>14.1 µl</td></tr>
-
primer&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 20 µl</td></tr>
-
0.4 &micro;L<br>
+
</table>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; R
+
</td><TD></TD><TD></TD><td>
-
primer&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;  
+
<table border="0" width="100px">
-
0.4
+
<tr><td align=center>Cycle条件</td></tr>
-
&micro;L&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
+
</table>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<table border=1 width="400px">
-
Templet
+
<tr><td width="100px" align=center>Pre-Denature</td><td width="100px"  align=center>94°C</td><td width="100px"  align=center>2min</td></td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
-
DNA&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;  
+
<tr><td align=center>Denature</td><td align=center>94°C</td><td align=center>30sec</td><td align=center rowspan=3>37 Cycle</td></tr>
-
1 &micro;L<br>
+
<tr><td align=center>Anneling</td><td align=center>51.5°C</td><td align=center>30sec</td></tr>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
<tr><td align=center>Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>1kb/min</td></tr>
-
milliQ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;14.1
+
<tr><td align=center>+Extension</td><td align=center>72°C</td><td align=center>10min</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
-
&micro;L<br>
+
<tr><td align=center>End</td><td align=center>4°C</td><td align=center>keep</td><td width="100px">&nbsp;</td></tr>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
+
</table>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
</td></tr>
-
上記の分量を混合した。<br>
+
</table>
-
   <br>
+
<br>
-
   *&lt;プライマーの塩基配列&gt;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
+
*プライマーの塩基配列<br>
-
    ・API2-MALT1<br>
+
・API2-MALT1<br>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
F primer<br>  
-
F
+
      GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT<br>
-
primer&nbsp;&nbsp;:&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
Tm値<br>
 +
      57.8 ゜C<br>  
 +
R primer<br>
 +
      GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA<br>
Tm値<br>
Tm値<br>
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
      56.5 ゜C<br>  
-
GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
増幅サイズ  約3131 bp<br>   
-
57.8
+
-
℃<br>
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
R
+
-
primer<br>
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
56.5  
+
-
<br>
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
増幅サイズ  約3131 bp<br>
+
-
   &nbsp;<br>
+
-
&nbsp;<br>
+
-
   
+
-
(2)PCR反応条件<br>
+
-
   &lt;1&gt;×1   Pre-denature&nbsp;   94 ℃   2
+
-
min<br>
+
-
<br>
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
&lt;2&gt;×37  Denature&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;   94 ℃  &nbsp;
+
-
15
+
-
sec<br>
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;Annealing&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
51.5 ℃  &nbsp;&nbsp; 30
+
-
sec<br>
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
Extension&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 72
+
-
℃&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 3 min&nbsp; 20
+
-
sec<br>
+
-
<br>
+
-
<br>
+
-
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
+
-
上記の条件でPCRを行った。<br>
+
-
<br>
+
<br>
<br>
<br>
<br>
Line 938: Line 1,020:
PCR産物の制限酵素処理<br>
PCR産物の制限酵素処理<br>
<br>
<br>
-
【実験操作】<font color=red>←ぷろとこるをコピペする!!</font><br>
+
【実験操作】<br>↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた。<BR>
-
 (1)PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)<br>
+
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。<BR>
-
   PCR産物を400
+
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した。<BR>
-
&micro;LまでmilliQで薄め、フェノールクロロホルムを400 &micro;L加えて攪拌した。<br>
+
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
-
   ↓10000 rpm、3
+
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。<BR>
-
min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。<br>
+
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した。<BR>
-
   ↓クロロホルムを等量加えて攪拌した。<br>
+
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
-
   ↓10000 rpm、3
+
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2~3min静置した。<BR>
-
min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。<br>
+
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。<BR>
-
   ↓3 M&nbsp; 酢酸ナトリウム(pH
+
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。<BR>
-
5.27)を1/10量加え、イソプロパノールを等量加え、3 min静置した。<br>
+
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。<BR>
-
   ↓14000 rpm、10
+
↓上澄みを捨て、乾燥させた。<BR>
-
min、4℃で遠心後、上清を捨て70%エタノールを200 &micro;L加えた。<br>
+
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした。<BR>
-
   ↓15000 rpm、5
+
-
min、4℃で遠心後、上清を捨て乾燥させた。<br>
+
-
   ↓乾燥後、milliQ44 &micro;Lを加えて攪拌した。<br>
+
-
   この溶液にXhoIを1 &micro;L、10×H
+
-
Bufferを5 &micro;Lを加え、37℃で20時間静置した。<br>
+
-
<br>
+
-
<br>
+
<br>
<br>
 +
下記の組成に従って反応液を調整した。<BR>
 +
 +
<TABLE border="0"><TR><TD>
 +
<table border="0">
 +
<tr><td>cDNA</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="200px">
 +
<tr><td width"150px" align=center>PCR産物 in ddH<sub>2</sub>O</td><td width"50px" align=right>44 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center><I>Xho</I>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</TD><TD></TD><TD></TD><TD>
 +
<table border="0">
 +
<tr><td>vector</td></tr>
 +
</table>
 +
<table border=1 width="250px">
 +
<tr><td width"200px" align=center>PUAST-flag vector(500 ng/µl)</td><td width"50px" align=right>10 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>ddH<sub>2</sub>O</td><td align=right>34 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center>10 x H Buffer</td><td align=right>5 µl</td></tr>
 +
<tr><td align=center><I>Xho</I>Ⅰ</td><td align=right>1 µl</td></tr>
 +
<tr><td>&nbsp;</td><td align=right>total 50 µl</td></tr>
 +
</table>
 +
</TD></TR>
 +
</TABLE>
 +
 +
 +
37°Cで20時間静置した。
 +
 +
<BR>
 +
9月16日(金)<br>
9月16日(金)<br>
<br>
<br>
Line 966: Line 1,072:
PCR産物の制限酵素処理<br>
PCR産物の制限酵素処理<br>
<br>
<br>
-
【実験操作】<font color=red>←ぷろとこるをコピペする!!</font><br>
+
【実験操作】<br>↓PCR産物を400 µlまでddH<sub>2</sub>Oで薄めた。<BR>
-
 (1)PCR産物の精製(フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿)<br>
+
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。<BR>
-
   PCR産物を400
+
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した。<BR>
-
&micro;LまでmilliQで薄め、フェノールクロロホルムを400 &micro;L加えて攪拌した。<br>
+
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
-
   ↓10000 rpm、3
+
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。<BR>
-
min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。<br>
+
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した。<BR>
-
   ↓クロロホルムを等量加えて攪拌した。<br>
+
↓水層のみを新しいチューブに移した。<BR>
-
   ↓10000 rpm、3
+
↓3M CH<sub>3</sub>COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2~3min静置した。<BR>
-
min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。<br>
+
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。<BR>
-
   ↓3 M&nbsp; 酢酸ナトリウム(pH
+
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。<BR>
-
5.27)を1/10量加え、イソプロパノールを等量加え、3 min静置した。<br>
+
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。<BR>
-
   ↓14000 rpm、10
+
↓上澄みを捨て、乾燥させた。<BR>
-
min、4℃で遠心後、上清を捨て70%エタノールを200 &micro;L加えた。<br>
+
↓ddH<sub>2</sub>Oを44 µl加えてvoltexした。<BR>
-
   ↓15000 rpm、5
+
<br>
-
min、4℃で遠心後、上清を捨て乾燥させた。<br>
+
下記の組成に従って反応液を調整した。<BR>
-
   乾燥後、TE44 &micro;Lを加えて攪拌し-20℃で保存した。<br>
+
-
 
+
<br>
<br>
<br><br>
<br><br>

Latest revision as of 04:27, 30 September 2011

8月8日(月)

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】

PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling(Tm-5)°C30sec
Extension72°C1kb/min
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

下記の組成に従って試薬をまぜた。
右に示したプログラムで反応を行った。

*<プライマーの塩基配列>
・DIAP2
F primer:GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT
Tm値 69゜C
R primer:GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA
Tm値 66.4゜C
増幅サイズ  約1514 bp

・API2-MALT1
F primer:GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT Tm値 57.8゜C
R primer:GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値 56.5゜C
増幅サイズ  約3131 bp


8月9日(火)

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の確認
【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl

上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。


【目的】
pUAST溶液の形質転換
【実験操作】
↓pUAST 1 µlとコンピテントセルを混合した。
↓これを氷上で15min放置した。
↓43°Cで30sec温め、氷上で10min放置した。
↓これをLBプレートに塗り37°Cでincubateした。

8月10日(水)

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling(Tm-5)°C30sec
Extension72°C1kb/min
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

下記の組成に従って試薬をまぜた。
右に示したプログラムで反応を行った。

【目的】
大腸菌の培養

【実験操作】
↓ガスバーナーで加熱滅菌したつまようじでLB(amp+)プレートから生えてきた大腸菌のコロニーをついた。
↓ついた先端を2個のLB培地(amp+)2 mlに攪拌した。
↓pUASTとコンピテントセルの混合物を10 µl、100 µlをそれぞれまいた。

8月11日(木)

松浪

【目的】
pUAST flag vectorの大量精製

【実験操作】
↓培養液1.5 mLを、15000 rpm、5min、4°Cの条件で遠心した。この間にglucose solution、5M K-acetate pH 4.8を氷上で冷やした。
↓上清を廃棄しglucose solution 100 µl加えて攪拌し、沈殿物を溶解した。
↓0.2N NaOH 1% SDS 200 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。
↓5M K-acetate pH 4.8 150 µlを加えてよく混ぜ、氷上に5min放置した。
↓15000 rpm、10min、4°Cの条件で遠心した。
↓上清を新しいチューブに移し、isopropanolを等量入れ攪拌し3min静置した。
↓15000 rpm、10min、25°Cの条件で遠心した。
↓上清を廃棄し70% EtOH 200 µlを加えて軽く攪拌し3min静置した。その後、15000 rpm、10min、25°Cの条件で再び遠心した。
↓上清を廃棄し乾燥させてRnase in TE 20 µlを加えた。
 
【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

8月12日(金)

松浪、横井川

【目的】
pUAST flag vectorの大量精製

【実験操作】
↓培養した大腸菌をオートクレーブした遠心管で4000 G、10min、25°Cの条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
↓R3 with RNase A4 を4 mL加えて、攪拌し完全に溶解させた。
↓L7を4 mLを加え丁寧に混合し5min室温で静置した。
↓N3を4 mL加えてすぐに混ぜた。これを12000 G、10min、25°Cの条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
↓事前にEQ1 10 mLを加えて平衡化していたカラムに上清をLoadし、上清が流れ落ちるのを待った。このとき、一部をチューブに保存した。
↓Wash Buffer (W8) 10 mLを加えて洗浄した。これを2回行った。
↓Elution buffer (E4)を5 mL加えてDNAを溶出させた。追加で、E4 2 mLをLoadし、別のチューブに保存した。
↓isopropanol 3.5 mLを加えて混合し、これを15000 G、40min、4°Cの条件で遠心し、上清を捨てた。
↓70% EtOH 3mLを加えて再懸濁し、15000G、5min、4℃の条件で再び遠心し、上清を捨てた。
↓Air-dryで乾燥させ200 µlでのTEに溶かした。

↓次にこの溶液のDNA濃度測定を行った。
↓ddH2O 100 µlおよび、精製したDNA溶液を100倍希釈した溶液を準備した。
↓ddH2O 100 µlでゼロ補正を行い、サンプル1、5の吸光度を測定した。結果を以下に示す(表1)。
表1、サンプル1、5の吸光度の値
サンプル1
0.1890.2080.1920.1900.191

 平均は0.194であった。
これより、サンプル1のDNA濃度は0.970 µg/µlであった。

サンプル5
0.2820.2760.2780.2690.269

平均は0.275でった。
これより、サンプル5のDNA濃度は1.37 µg/µlであった。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。


8月15日(月)

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
・API2-MALT1
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling58.9°C30sec
Extension72°C1kb/min
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

・DIAP2
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling53°C30sec
Extension72°C1kb/min
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

下記の組成に従って試薬をまぜた。
右に示したプログラムで反応を行った。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。


8月16日(火)

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
・API2-MALT1
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling53°C30sec
Extension72°C1kb/min
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 
・DIAP2
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling58.9°C30sec
Extension72°C1kb/min
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。



8月17日(水)

松浪、横井川


【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
・API2-MALT1
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling53.5°C30sec
Extension72°C1kb/min
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 
・DIAP2
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension72°C1kb/min
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 
【目的】
 PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。

   8/23(火)

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】←ぷろとこるのテーブルをコピペする!!
 (1)PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
   KOD+ polymelase           1 µL
       10 x Buffer                           2 µL      
       dNTP(2.0 µM)                         5 µL
       F primer(10 µM)                    1.5 µL
       R primer(10 µM)                    1.5 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                   33 µL
       
       上記の分量を混合した。
   
                  
 
  (2)PCR反応条件
   <1>×1   Pre-denature    94 ℃   2 min

       <2>×35  Denature          94 ℃    15 sec
          
       ・DIAP2
                       Annealing        50.5 ℃     30 sec
                       Extension          68 ℃       1 min 40 sec
               ・API2-MALT1
           Annealing              ℃     30 sec
                       Extension          68 ℃       3 min


       <3>                                   72℃    10 min
       <4>                                     4℃        ∞
                       

        上記の条件でPCRを行った。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。



8月24日(水)

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
・API2-MALT1
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling51.5°C30sec
Extension72°C1kb/min
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 
鋳型DNAを10、100倍希釈後、上記の条件でPCRを行った。

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。


8月25日(木)

松浪

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】←ぷろとこるのテーブルをコピペする!!
・API2-MALT1
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling51.5°C30sec
Extension72°C1kb/min
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

    ・DIAP2
 (1)PCR反応液の調製()
       <1本分あたり>
   KOD+ polymelase           1 µL
       10 x Buffer                           2 µL      
       dNTP(2.0 µM)                         5 µL
       F primer(10 µM)                    1.5 µL
       R primer(10 µM)                    1.5 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                   33 µL
       
       上記の分量を混合した。
                  
 
  (2)PCR反応条件
   <1>×1   Pre-denature    94 ℃   2 min

       <2>×35  Denature          94 ℃    15 sec
                       Annealing        50.5 ℃     30 sec
                       Extension          68 ℃       1 min 40 sec

       <3>                                   4℃        ∞
                       

        上記の条件でPCRを行った。


【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。






9月12日(月)
松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】←ぷろとこるのテーブルをコピペする!!
 (1)PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
   KOD+ polymelase           1 µL
       10 x Buffer                           2 µL      
       dNTP(2.0 µM)                         5 µL
       F primer(10 µM)                    1.5 µL
       R primer(10 µM)                    1.5 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                   33 µL
       
       上記の分量を混合した。
   
   *<プライマーの塩基配列>
     ・DIAP2
              F primer  :                                                             Tm値
                 GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT    62 ℃
       R primer  :
                 GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA           66.4 ℃
      増幅サイズ  約1514 bp

               
 
  (2)PCR反応条件
   <1>×1   Pre-denature    94 ℃   2 min

       <2>×35  Denature          94 ℃    15 sec
                       Annealing        50.5 ℃     30 sec
                       Extension          68 ℃       1 min 40 sec

       <3>                                   4℃        ∞
                       

        上記の条件でPCRを行った。



9月13日(火)

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。



9月14日(水)

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
PCR条件
10 µM Primer F0.4 µl
10 µM Primer R0.4 µl
Template DNA1 µl
10 x Ex Taq Buffer2 µl
Takara Ex Taq0.1 µl
2.0 mM dNTPs2 µl
ddH2O14.1 µl
 total 20 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C30sec37 Cycle
Anneling51.5°C30sec
Extension72°C1kb/min
+Extension72°C10min 
End4°Ckeep 

*プライマーの塩基配列
・API2-MALT1
F primer
GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT
Tm値
57.8 ゜C
R primer
GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA
Tm値
56.5 ゜C
増幅サイズ  約3131 bp
 

【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。


9月15日(木)

松浪、横井川

【目的】
cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験方法】
以下の条件でPCRを行った。
PCR条件
10 µM Primer F1.5 µl
10 µM Primer R1.5 µl
Template DNA1 µl
10 x PCR Buffer for KOD Plus5 µl
dNTPs5 µl
MgSO42 µl
ddH2O33 µl
KOD Plus1 µl
 total 50 µl
Cycle条件
Pre-Denature94°C2min 
Denature94°C15sec35 Cycle
Anneling50.5°C30sec
Extension68°C1min 40sec
End4°Ckeep 

各サンプルを回収し、-20゜Cで保存した。    
   *<プライマーの塩基配列>
     ・DIAP2
              F primer  :                                                             Tm値
                 GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT    62 ℃
       R primer  :
                 GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA           66.4 ℃
      増幅サイズ  約1514 bp

               
 
 
【目的】
PCR産物の確認

【実験操作】
PCR反応液2 µl
ddH2O8 µl
6 x loading dye2 µl
上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30minの条件で電気泳動した。
EtBr染色を行い、写真を撮った。


【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2~3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。
cDNA
PCR産物 in ddH2O44 µl
10 x H Buffer5 µl
Xho1 µl
 total 50 µl
vector
PUAST-flag vector(500 ng/µl)10 µl
ddH2O34 µl
10 x H Buffer5 µl
Xho1 µl
 total 50 µl
37°Cで20時間静置した。
9月16日(金)

松浪、横井川

【目的】
PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
↓PCR産物を400 µlまでddH2Oで薄めた。
↓phenol-choloroform(φOH/CIAA)を400 µl加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓choloroform(CIAA)を等量加えてvoltexした。
↓10000rpm、4°Cで2~3min遠心した。
↓水層のみを新しいチューブに移した。
↓3M CH3COONa(pH 5.27)を1/10量、100% ethanolを3倍量加えて、2~3min静置した。
↓15000rpm、4°Cで10min遠心した。
↓上澄みを捨て、70% ethanol(EtOH)を200 µl加えた。
↓15000rpm、4°Cで5min遠心した。
↓上澄みを捨て、乾燥させた。
↓ddH2Oを44 µl加えてvoltexした。

下記の組成に従って反応液を調整した。