Team:KIT-Kyoto/matsunami

From 2011.igem.org

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<meta http-equiv="Content-Type" content="text/html; charset=shift_jis">
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<title></title>
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<p>８/23(火)<br>
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松浪<br>
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【目的】<br>
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　cDNA
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vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
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【実験操作】<br>
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　（1）PCR反応液の調製<br>
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&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
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&lt;1本分あたり&gt;<br>
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　　　KOD+ polymelase　　　　　　　 　&nbsp; 1
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&micro;L<br>
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&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 10 x
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Buffer　&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
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2 &micro;L　　　　　　<br>
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&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; dNTP(2.0
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&micro;M)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;5
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&micro;L<br>
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&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;F primer(10
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&micro;M)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
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1.5 &micro;L<br>
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&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; R primer(10
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&micro;M)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
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1.5
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&micro;L&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
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&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
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Templet
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DNA&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
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1 &micro;L<br>
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milliQ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;33
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&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
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&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
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上記の分量を混合した。<br>
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　　　<br>
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　　　&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
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　　　&nbsp;<br>
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&nbsp;<br>
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　 (2)PCR反応条件<br>
 +
　　　&lt;1&gt;×1　　　Pre-denature&nbsp; 　 94
 +
℃　　　2 min<br>
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<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
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&lt;2&gt;×35　　Denature&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 　 94 ℃　　&nbsp;
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15
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sec<br>
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　　　　　　　　　　<br>
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　　　　　　　・DIAP2<br>
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&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
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Annealing&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;50.5 ℃　　&nbsp;&nbsp; 30
 +
sec<br>
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&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
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Extension&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;68
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℃&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 1 min 40
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sec<br>
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&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;・API2-MALT1<br>
 +
　　　　　　　　　　
 +
Annealing&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;℃　　&nbsp;&nbsp;
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30
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sec<br>
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&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
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Extension&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;68
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℃&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;3
 +
min<br>
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<br>
 +
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&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&lt;3&gt;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
72℃　　　　10 min<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
&lt;4&gt;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;4℃&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
∞<br>
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&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
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&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
上記の条件でPCRを行った。<br>
 +
<br>
 +
【目的】<br>
 +
　PCR産物の確認<br>
 +
<br>
 +
【実験操作】<br>
 +
&nbsp;&nbsp;PCR反応液　　　&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
2 &micro;L<br>
 +
&nbsp;
 +
milliQ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
8 &micro;L<br>
 +
&nbsp; 6 x loading dye&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 2
 +
&micro;L<br>
 +
&nbsp; 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100
 +
V、30分の条件で電気泳動した。<br>
 +
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
 +
<br>
 +
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 +
<br>
 +
8月24日（水）<br>
 +
<br>
 +
松浪<br>
 +
<br>
 +
【目的】<br>
 +
　cDNA
 +
vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
 +
<br>
 +
【実験操作】<br>
 +
　（1）PCR反応液の調製<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
&lt;1本分あたり&gt;<br>
 +
　　　Takara&nbsp;Ex&nbsp;Taq　　　　　　　　　　0.1
 +
&micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 10 x Ex Taq
 +
Buffer　&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
2 &micro;L　　　　　　<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; dNTP(2.0
 +
&micro;M)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
2 &micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;F
 +
primer&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
0.4 &micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; R
 +
primer&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
0.4
 +
&micro;L&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
Templet
 +
DNA&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
1 &micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
milliQ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;14.1
 +
&micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
上記の分量を混合した。<br>
 +
　　　ただし、10倍希釈、100倍希釈したAPI2-MALT1のTemplet DNAを用いた。<br>
 +
&nbsp;<br>
 +
　
 +
(2)PCR反応条件<br>
 +
　　　&lt;1&gt;×1　　　Pre-denature&nbsp; 　 94 ℃　　　2
 +
min<br>
 +
<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
&lt;2&gt;×37　　Denature&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 　 94 ℃　　&nbsp;
 +
15
 +
sec<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;Annealing&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
51.5 ℃　　&nbsp;&nbsp; 30
 +
sec<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
Extension&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 72
 +
℃&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 3 min&nbsp; 20
 +
sec<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
上記の条件でPCRを行った。<br>
 +
<br>
 +
【目的】<br>
 +
　PCR産物の確認<br>
 +
<br>
 +
【実験操作】<br>
 +
&nbsp;&nbsp;PCR反応液　　　&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
2 &micro;L<br>
 +
&nbsp;
 +
milliQ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
8 &micro;L<br>
 +
&nbsp; 6 x loading dye&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 2
 +
&micro;L<br>
 +
&nbsp; 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100
 +
V、30分の条件で電気泳動した。<br>
 +
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
8月25日（木）<br>
 +
<br>
 +
松浪<br>
 +
<br>
 +
【目的】<br>
 +
　cDNA
 +
vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
 +
<br>
 +
【実験操作】<br>
 +
　 ・API2-MALT1<br>
 +
&nbsp;
 +
（1）PCR反応液の調製<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
&lt;1本分あたり&gt;<br>
 +
　　　Takara&nbsp;Ex&nbsp;Taq　　　　　　　　　　0.1
 +
&micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 10 x Ex Taq
 +
Buffer　&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
2 &micro;L　　　　　　<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; dNTP(2.0
 +
&micro;M)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
2 &micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;F
 +
primer&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
0.4 &micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; R
 +
primer&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
0.4
 +
&micro;L&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
Templet
 +
DNA&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
1 &micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
milliQ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;14.1
 +
&micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
上記の分量を混合した。<br>
 +
　　　&nbsp;<br>
 +
　 (2)PCR反応条件<br>
 +
　　　&lt;1&gt;×1　　　Pre-denature&nbsp;
 +
　 94 ℃　　　2 min<br>
 +
<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
&lt;2&gt;×37　　Denature&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 　 94 ℃　　&nbsp;
 +
15
 +
sec<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;Annealing&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
51.5 ℃　　&nbsp;&nbsp; 30
 +
sec<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
Extension&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 72
 +
℃&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 3 min&nbsp; 20
 +
sec<br>
 +
<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
・DIAP2<br>
 +
　（1）PCR反応液の調製()<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
&lt;1本分あたり&gt;<br>
 +
　　　KOD+ polymelase　　　　　　　 　&nbsp; 1
 +
&micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 10 x
 +
Buffer　&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
2 &micro;L　　　　　　<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; dNTP(2.0
 +
&micro;M)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;5
 +
&micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;F primer(10
 +
&micro;M)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
1.5 &micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; R primer(10
 +
&micro;M)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
1.5
 +
&micro;L&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
Templet
 +
DNA&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
1 &micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
milliQ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;33
 +
&micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
上記の分量を混合した。<br>
 +
　　　&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
　　　&nbsp;<br>
 +
&nbsp;<br>
 +
　 (2)PCR反応条件<br>
 +
　　　&lt;1&gt;×1　　　Pre-denature&nbsp; 　 94
 +
℃　　　2 min<br>
 +
<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
&lt;2&gt;×35　　Denature&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 　 94 ℃　　&nbsp;
 +
15
 +
sec<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
Annealing&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;50.5 ℃　　&nbsp;&nbsp; 30
 +
sec<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
Extension&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;68
 +
℃&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 1 min 40
 +
sec<br>
 +
<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&lt;3&gt;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
　4℃&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
∞<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
 +
<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
上記の条件でPCRを行った。<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
【目的】<br>
 +
　PCR産物の確認<br>
 +
<br>
 +
【実験操作】<br>
 +
&nbsp;&nbsp;PCR反応液　　　&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
2 &micro;L<br>
 +
&nbsp;
 +
milliQ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
8 &micro;L<br>
 +
&nbsp; 6 x loading dye&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 2
 +
&micro;L<br>
 +
&nbsp; 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100
 +
V、30分の条件で電気泳動した。<br>
 +
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
 +
</p>
 +
</body>
 +
</html>
 +
 +
 +
<html>
 +
<head>
 +
<meta http-equiv="Content-Type" content="text/html; charset=shift_jis">
 +
<title></title>
 +
</head>
 +
<body>
 +
<p>9月12日（月）<br>
 +
<br>
 +
松浪、横井川<br>
 +
<br>
 +
【目的】<br>
 +
　cDNA
 +
vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
 +
<br>
 +
【実験操作】<br>
 +
　（1）PCR反応液の調製<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
&lt;1本分あたり&gt;<br>
 +
　　　KOD+ polymelase　　　　　　　 　&nbsp;
 +
1
 +
&micro;L<br>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 10 x
 +
Buffer　&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
2 &micro;L　　　　　　<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
dNTP(2.0
 +
&micro;M)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;5 &micro;L<br>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;F
 +
primer(10
 +
&micro;M)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
1.5 &micro;L<br>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
R primer(10
 +
&micro;M)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
1.5
 +
&micro;L&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
Templet
 +
DNA&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
1 &micro;L<br>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
milliQ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;33
 +
&micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
上記の分量を混合した。<br>
 +
　　　<br>
 +
　　　＊&lt;プライマーの塩基配列&gt;<br>
 +
　　　　　・DIAP2<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
F
 +
primer&nbsp;&nbsp;:&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
Tm値<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT　　　 62 ℃<br>
 +
　　　　　　 R primer&nbsp;
 +
:<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
66.4 ℃<br>
 +
　　　　　　増幅サイズ　　約1514
 +
bp<br>
 +
<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
　　　&nbsp;<br>
 +
&nbsp;<br>
 +
　 (2)PCR反応条件<br>
 +
　　　&lt;1&gt;×1　　　Pre-denature&nbsp; 　 94
 +
℃　　　2 min<br>
 +
<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
&lt;2&gt;×35　　Denature&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 　 94 ℃　　&nbsp;
 +
15
 +
sec<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
Annealing&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;50.5 ℃　　&nbsp;&nbsp; 30
 +
sec<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
Extension&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;68
 +
℃&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 1 min 40
 +
sec<br>
 +
<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&lt;3&gt;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
　4℃&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
∞<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
 +
<br>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
上記の条件でPCRを行った。<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
9月13日（火）<br>
 +
<br>
 +
松浪、横井川<br>
 +
<br>
 +
【目的】<br>
 +
　PCR産物の確認<br>
 +
<br>
 +
【実験操作】<br>
 +
&nbsp;&nbsp;PCR反応液　　　&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
2 &micro;L<br>
 +
&nbsp;
 +
milliQ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
8 &micro;L<br>
 +
&nbsp; 6 x loading dye&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 2
 +
&micro;L<br>
 +
&nbsp; 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100
 +
V、30分の条件で電気泳動した。<br>
 +
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
9月14日（水）<br>
 +
<br>
 +
松浪、横井川<br>
 +
<br>
 +
【目的】<br>
 +
　cDNA
 +
vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
 +
<br>
 +
【実験操作】<br>
 +
　（1）PCR反応液の調製<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
&lt;1本分あたり&gt;<br>
 +
　　　Takara&nbsp;Ex&nbsp;Taq　　　　　　　　　　0.1
 +
&micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 10 x Ex Taq
 +
Buffer　&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
2 &micro;L　　　　　　<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; dNTP(2.0
 +
&micro;M)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
2 &micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;F
 +
primer&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
0.4 &micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; R
 +
primer&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
0.4
 +
&micro;L&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
Templet
 +
DNA&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
1 &micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
milliQ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;14.1
 +
&micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
上記の分量を混合した。<br>
 +
　　　<br>
 +
　　　＊&lt;プライマーの塩基配列&gt;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
 +
　　　　・API2-MALT1<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
F
 +
primer&nbsp;&nbsp;:&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
Tm値<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
57.8
 +
℃<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
R
 +
primer<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
56.5
 +
℃<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
増幅サイズ　　約3131 bp<br>
 +
　　　&nbsp;<br>
 +
&nbsp;<br>
 +
　
 +
(2)PCR反応条件<br>
 +
　　　&lt;1&gt;×1　　　Pre-denature&nbsp; 　 94 ℃　　　2
 +
min<br>
 +
<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
&lt;2&gt;×37　　Denature&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 　 94 ℃　　&nbsp;
 +
15
 +
sec<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;　&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;Annealing&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
51.5 ℃　　&nbsp;&nbsp; 30
 +
sec<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
Extension&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 72
 +
℃&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 3 min&nbsp; 20
 +
sec<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
上記の条件でPCRを行った。<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
【目的】<br>
 +
　PCR産物の確認<br>
 +
<br>
 +
【実験操作】<br>
 +
&nbsp;&nbsp;PCR反応液　　　&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
2 &micro;L<br>
 +
&nbsp;
 +
milliQ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
8 &micro;L<br>
 +
&nbsp; 6 x loading dye&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 2
 +
&micro;L<br>
 +
&nbsp; 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100
 +
V、30分の条件で電気泳動した。<br>
 +
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
9月15日（木）<br>
 +
<br>
 +
松浪、横井川<br>
 +
<br>
 +
【目的】<br>
 +
　cDNA
 +
vectorを鋳型としたcDNAの増殖<br>
 +
<br>
 +
【実験操作】<br>
 +
　（1）PCR反応液の調製<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
&lt;1本分あたり&gt;<br>
 +
　　　KOD+ polymelase　　　　　　　 　&nbsp;
 +
1
 +
&micro;L<br>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 10 x
 +
Buffer　&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
2 &micro;L　　　　　　<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
dNTP(2.0
 +
&micro;M)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;5 &micro;L<br>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;F
 +
primer(10
 +
&micro;M)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
1.5 &micro;L<br>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
R primer(10
 +
&micro;M)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
1.5
 +
&micro;L&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
Templet
 +
DNA&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
1 &micro;L<br>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
milliQ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;33
 +
&micro;L<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
上記の分量を混合した。<br>
 +
　　　<br>
 +
　　　＊&lt;プライマーの塩基配列&gt;<br>
 +
　　　　　・DIAP2<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
F
 +
primer&nbsp;&nbsp;:&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
Tm値<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT　　　 62 ℃<br>
 +
　　　　　　 R primer&nbsp;
 +
:<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
66.4 ℃<br>
 +
　　　　　　増幅サイズ　　約1514
 +
bp<br>
 +
<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
　　　&nbsp;<br>
 +
&nbsp;<br>
 +
　 (2)PCR反応条件<br>
 +
　　　&lt;1&gt;×1　　　Pre-denature&nbsp; 　 94
 +
℃　　　2 min<br>
 +
<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
&lt;2&gt;×35　　Denature&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 　 94 ℃　　&nbsp;
 +
15
 +
sec<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
Annealing&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;50.5 ℃　　&nbsp;&nbsp; 30
 +
sec<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
Extension&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;68
 +
℃&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 1 min 40
 +
sec<br>
 +
<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&lt;3&gt;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
　4℃&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
∞<br>
 +
&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;<br>
 +
<br>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
上記の条件でPCRを行った。<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
【目的】<br>
 +
　PCR産物の確認<br>
 +
<br>
 +
【実験操作】<br>
 +
&nbsp;&nbsp;PCR反応液　　　&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
2 &micro;L<br>
 +
&nbsp;
 +
milliQ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;
 +
8 &micro;L<br>
 +
&nbsp; 6 x loading dye&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 2
 +
&micro;L<br>
 +
&nbsp; 上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100
 +
V、30分の条件で電気泳動した。<br>
 +
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
【目的】<br>
 +
　PCR産物の制限酵素処理<br>
 +
<br>
 +
【実験操作】<br>
 +
　(1)PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）<br>
 +
　　　PCR産物を400
 +
&micro;LまでmilliQで薄め、フェノールクロロホルムを400 &micro;L加えて攪拌した。<br>
 +
　　　↓10000 rpm、3
 +
min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。<br>
 +
　　　↓クロロホルムを等量加えて攪拌した。<br>
 +
　　　↓10000 rpm、3
 +
min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。<br>
 +
　　　↓3 M&nbsp; 酢酸ナトリウム（pH
 +
5.27）を1/10量加え、イソプロパノールを等量加え、3 min静置した。<br>
 +
　　　↓14000 rpm、10
 +
min、4℃で遠心後、上清を捨て70％エタノールを200 &micro;L加えた。<br>
 +
　　　↓15000 rpm、5
 +
min、4℃で遠心後、上清を捨て乾燥させた。<br>
 +
　　　↓乾燥後、milliQ44 &micro;Lを加えて攪拌した。<br>
 +
　　　この溶液にXhoIを1 &micro;L、10×H
 +
Bufferを5 &micro;Lを加え、37℃で20時間静置した。<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
9月16日（金）<br>
 +
<br>
 +
松浪、横井川<br>
 +
<br>
 +
【目的】<br>
 +
　PCR産物の制限酵素処理<br>
 +
<br>
 +
【実験操作】<br>
 +
　(1)PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）<br>
 +
　　　PCR産物を400
 +
&micro;LまでmilliQで薄め、フェノールクロロホルムを400 &micro;L加えて攪拌した。<br>
 +
　　　↓10000 rpm、3
 +
min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。<br>
 +
　　　↓クロロホルムを等量加えて攪拌した。<br>
 +
　　　↓10000 rpm、3
 +
min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。<br>
 +
　　　↓3 M&nbsp; 酢酸ナトリウム（pH
 +
5.27）を1/10量加え、イソプロパノールを等量加え、3 min静置した。<br>
 +
　　　↓14000 rpm、10
 +
min、4℃で遠心後、上清を捨て70％エタノールを200 &micro;L加えた。<br>
 +
　　　↓15000 rpm、5
 +
min、4℃で遠心後、上清を捨て乾燥させた。<br>
 +
　　　乾燥後、TE44 &micro;Lを加えて攪拌し-20℃で保存した。<br>
 +
 +
<br>
 +
<br><br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
<br>
 +
 +
 +
<br>
 +
<br>
 +
</p>
</body>
</body>
</html>
</html>

Revision as of 14:07, 17 September 2011

あいうえお

　さささ 　ささｓｓｓ あああああ　
　ＴＥ 　50μＬ 　1000
　 　 　
　 　 　
　 　 　
　 　 　
　 　 　

8月8日（月）

松浪、横井川

【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
　（1）PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
　　　Takara Ex Taq　　　　　　　　　　0.1 µL
       10 x Ex Taq Buffer　                2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                         2 µL
       F primer                              0.4 µL
       R primer                              0.4 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                 14.1 µL
       
       上記の分量を混合した。
　　　
　　　＊<プライマーの塩基配列>
　　　　　・DIAP2
              F primer  :                                                             Tm値
                 GCTTCTCGAGACGGAGCTGGGCATGGAGCT　　　　　69 ℃
　　　　　　 R primer  :
                 GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA           66.4 ℃
　　　　　　増幅サイズ　　約1514 bp

           ・API2-MALT1
              F primer  :                                                             Tm値
                 GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT            57.8 ℃
              R primer
                 GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA              56.5 ℃
              増幅サイズ　　約3131 bp
　　　 
 
　 (2)PCR反応条件
　　　<1>×1　　　Pre-denature  　 94 ℃　　　2 min

       <2>×37　　Denature        　 94 ℃　　  15 sec

                       (DIAP2)
                       Annealing        56.9 ℃　　   30 sec
                       Extension          72 ℃       1 min 40 sec
                       (API2-MALT1)
                       Annealing        51.5 ℃　　   30 sec
                       Extension          72 ℃       3 min  20 sec


        上記の条件でPCRを行った。



8月9日（火）

松浪、横井川

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。


【目的】
　pUAST溶液の形質転換

【実験操作】
　pUAST　1 µLとコンピテントセルを混合した。
　↓これを氷上で15分間放置した。
　↓43℃で30秒間温め、氷上で10分間放置した。
　これをLBプレートに塗り37℃でincubateした。



8月10日（水）

松浪

【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
　8月8日と同様である。


【目的】
　大腸菌の培養

【実験操作】
　ガスバーナーで加熱滅菌したつまようじでLB（amp+）プレートから生えてきた大腸菌のコロニーをついた。
　↓ついた先端を2個のLB培地（amp+）2mLに攪拌した。
　pUASTとコンピテントセルの混合物を10 µL、100 µLをそれぞれまいた。


8月11日（木）

松浪

【目的】
　pUAST flag vectorの大量精製

【実験操作】
　培養液1.5 mLを、15000rpm、5分、4℃の条件で遠心した。この間にglucose solution、5M K-acetate pH 4.8を氷上で冷やした。
　↓5分後、上清を廃棄しglucose solution　100 µL加えて攪拌した。
　↓沈殿物を溶解した後、0.2N NaOH 1% SDS 200 µLを加えてよく混ぜ、氷上に5分間放置した。
　↓5分後、5M K-acetate pH 4.8 150 µLを加えてよく混ぜ、氷上に5分間放置した。
　↓5分後、15000rpm、10分、4℃の条件で遠心した。
　↓上清を新しいチューブに移し、isopropanolを等量入れ攪拌し3分間静置した。
　↓3分後、15000rpm、10分、25℃の条件で遠心した。
　↓遠心後、上清を廃棄し70% EtOH 200 µLを加えて軽く攪拌し3分間静置した。その後、15000rpm、10分、25℃の条件で再び遠心した。
　遠心後、上清を廃棄し乾燥させてRnase in TE 20 µLを加えた。
　
【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。



8月12日（金）

松浪、横井川

【目的】
　pUAST flag vectorの大量精製

【実験操作】
　培養した大腸菌をオートクレーブした遠心管で4000G、10分、25℃の条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
　↓R3 with RNase A4 を4 mL加えて、攪拌し完全に溶解させた。
　↓L7を4 mLを加え丁寧に混合し5分間室温で静置した。
　↓5分後、N3を4 mL加えてすぐに混ぜた。これを12000G、10分、25℃の条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
　↓事前にEQ1 10 mLを加えて平衡化していたカラムに上清をLoadし、上清が流れ落ちるのを待った。このとき、一部をチューブに保存した。
　↓Wash Buffer (W8) 10 mLを加えて洗浄した。これを2回行った。
　↓Elution buffer (E4)を5 mL加えてDNAを溶出させた。追加で、E4 2 mLをLoadし、別のチューブに保存した。
　↓isopropanol 3.5 mLを加えて混合し、これを15000G、40分、4℃の条件で遠心し、遠心後上清を捨てた。
　↓70%　EtOH 3mLを加えて再懸濁し、15000G、5分、4℃の条件で再び遠心し、遠心後上清を捨てた。
　Air-dryで乾燥させ200 µLでのTEに溶かした。

　次にこの溶液のDNA濃度測定を行った。
　milliQ 100 µLおよび、精製したDNA溶液を100倍希釈した溶液を準備した。
　↓milliQ 100 µLでゼロ補正を行い、サンプル1、5の吸光度を測定した。結果を以下に示す（表1）。
　　　　　　　　　　　　　　　　表1、サンプル1、5の吸光度の値
　
　サンプル1

　0.189 　0.208 0.192　 0.190　 0.191　
平均は0.194であった。
これより、サンプル1のDNA濃度は0.970 µg/µLであった。

サンプル5
　0.282 0.276　 0.278　 0.269　 0.269　
平均は0.275でった。
これより、サンプル5のDNA濃度は1.37 µg/µLであった。

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。


8月15日（月）

松浪、横井川

【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
　8月8日と同じであるが、Annealing について以下のように変更した。
　DIAP2   　　　  　　　　 56.9℃
　API2-MALT1 　　　　　53℃

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。


8月16日（火）

松浪

【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
　8月8日と同じであるが、Annealing について以下のように変更した。
　DIAP2    　　　  　　 　　　　 58.9℃
　API2-MALT1        　　　　　53℃

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。



8月17日（水）

松浪、横井川


【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖とPCR産物の確認

【実験操作】
　8月8日と同じであるが、Annealing について以下のように変更した。
　DIAP2　　　　  　　 　　　　 50.5℃
　API2-MALT1　　　　　　　 53.5℃

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。





　


　　　


８/23(火)

松浪

【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
　（1）PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
　　　KOD+ polymelase　　　　　　　 　  1 µL
       10 x Buffer　                          2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                         5 µL
       F primer(10 µM)                    1.5 µL
       R primer(10 µM)                    1.5 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                   33 µL
       
       上記の分量を混合した。
　　　
　　　           　　　 
 
　 (2)PCR反応条件
　　　<1>×1　　　Pre-denature  　 94 ℃　　　2 min

       <2>×35　　Denature        　 94 ℃　　  15 sec
　　　　　　　　　　
　　　　　　　・DIAP2
                       Annealing        50.5 ℃　　   30 sec
                       Extension          68 ℃       1 min 40 sec
               ・API2-MALT1
　　　　　　　　　　 Annealing              ℃　　   30 sec
                       Extension          68 ℃       3 min


       <3>                                   72℃　　　　10 min
       <4>                                     4℃        ∞
                       

        上記の条件でPCRを行った。

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。



8月24日（水）

松浪

【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
　（1）PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
　　　Takara Ex Taq　　　　　　　　　　0.1 µL
       10 x Ex Taq Buffer　                2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                         2 µL
       F primer                              0.4 µL
       R primer                              0.4 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                 14.1 µL
       
       上記の分量を混合した。
　　　ただし、10倍希釈、100倍希釈したAPI2-MALT1のTemplet DNAを用いた。
 
　 (2)PCR反応条件
　　　<1>×1　　　Pre-denature  　 94 ℃　　　2 min

       <2>×37　　Denature        　 94 ℃　　  15 sec
                       Annealing        51.5 ℃　　   30 sec
                       Extension          72 ℃       3 min  20 sec


        上記の条件でPCRを行った。

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。


8月25日（木）

松浪

【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
　 ・API2-MALT1
  （1）PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
　　　Takara Ex Taq　　　　　　　　　　0.1 µL
       10 x Ex Taq Buffer　                2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                         2 µL
       F primer                              0.4 µL
       R primer                              0.4 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                 14.1 µL
       
       上記の分量を混合した。
　　　 
　 (2)PCR反応条件
　　　<1>×1　　　Pre-denature  　 94 ℃　　　2 min

       <2>×37　　Denature        　 94 ℃　　  15 sec
                       Annealing        51.5 ℃　　   30 sec
                       Extension          72 ℃       3 min  20 sec

    ・DIAP2
　（1）PCR反応液の調製()
       <1本分あたり>
　　　KOD+ polymelase　　　　　　　 　  1 µL
       10 x Buffer　                          2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                         5 µL
       F primer(10 µM)                    1.5 µL
       R primer(10 µM)                    1.5 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                   33 µL
       
       上記の分量を混合した。
　　　           　　　 
 
　 (2)PCR反応条件
　　　<1>×1　　　Pre-denature  　 94 ℃　　　2 min

       <2>×35　　Denature        　 94 ℃　　  15 sec
                       Annealing        50.5 ℃　　   30 sec
                       Extension          68 ℃       1 min 40 sec

       <3>                                  　4℃        ∞
                       

        上記の条件でPCRを行った。


【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。







9月12日（月）

松浪、横井川

【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
　（1）PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
　　　KOD+ polymelase　　　　　　　 　  1 µL
       10 x Buffer　                          2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                         5 µL
       F primer(10 µM)                    1.5 µL
       R primer(10 µM)                    1.5 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                   33 µL
       
       上記の分量を混合した。
　　　
　　　＊<プライマーの塩基配列>
　　　　　・DIAP2
              F primer  :                                                             Tm値
                 GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT　　　 62 ℃
　　　　　　 R primer  :
                 GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA           66.4 ℃
　　　　　　増幅サイズ　　約1514 bp

           　　　 
 
　 (2)PCR反応条件
　　　<1>×1　　　Pre-denature  　 94 ℃　　　2 min

       <2>×35　　Denature        　 94 ℃　　  15 sec
                       Annealing        50.5 ℃　　   30 sec
                       Extension          68 ℃       1 min 40 sec

       <3>                                  　4℃        ∞
                       

        上記の条件でPCRを行った。



9月13日（火）

松浪、横井川

【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。



9月14日（水）

松浪、横井川

【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
　（1）PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
　　　Takara Ex Taq　　　　　　　　　　0.1 µL
       10 x Ex Taq Buffer　                2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                         2 µL
       F primer                              0.4 µL
       R primer                              0.4 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                 14.1 µL
       
       上記の分量を混合した。
　　　
　　　＊<プライマーの塩基配列>   
　　　　・API2-MALT1
              F primer  :                                                             Tm値
                 GCCGCTCGAGAACATAGTAGAAAACAGCAT            57.8 ℃
              R primer
                 GCCGGCTAGCTCATTTTTCAGAAATTCTGA              56.5 ℃
              増幅サイズ　　約3131 bp
　　　 
 
　 (2)PCR反応条件
　　　<1>×1　　　Pre-denature  　 94 ℃　　　2 min

       <2>×37　　Denature        　 94 ℃　　  15 sec
            　         Annealing        51.5 ℃　　   30 sec
                       Extension          72 ℃       3 min  20 sec


        上記の条件でPCRを行った。



【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。


9月15日（木）

松浪、横井川

【目的】
　cDNA vectorを鋳型としたcDNAの増殖

【実験操作】
　（1）PCR反応液の調製
       <1本分あたり>
　　　KOD+ polymelase　　　　　　　 　  1 µL
       10 x Buffer　                          2 µL　　　　　　
       dNTP(2.0 µM)                         5 µL
       F primer(10 µM)                    1.5 µL
       R primer(10 µM)                    1.5 µL      
       Templet DNA                          1 µL
       milliQ                                   33 µL
       
       上記の分量を混合した。
　　　
　　　＊<プライマーの塩基配列>
　　　　　・DIAP2
              F primer  :                                                             Tm値
                 GCTTCTCGATTGACGGAGCTGGGCATGGAGCT　　　 62 ℃
　　　　　　 R primer  :
                 GCCGTCTAGATCACGAAAGGAACGTGCGCA           66.4 ℃
　　　　　　増幅サイズ　　約1514 bp

           　　　 
 
　 (2)PCR反応条件
　　　<1>×1　　　Pre-denature  　 94 ℃　　　2 min

       <2>×35　　Denature        　 94 ℃　　  15 sec
                       Annealing        50.5 ℃　　   30 sec
                       Extension          68 ℃       1 min 40 sec

       <3>                                  　4℃        ∞
                       

        上記の条件でPCRを行った。


【目的】
　PCR産物の確認

【実験操作】
  PCR反応液　　　    2 µL
  milliQ                    8 µL
  6 x loading dye       2 µL
  上記の溶液を混合し、この溶液を1%アガロースゲルで100 V、30分の条件で電気泳動した。
　泳動後、EtBr染色を行い、写真を撮った。


【目的】
　PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
　(1)PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
　　　PCR産物を400 µLまでmilliQで薄め、フェノールクロロホルムを400 µL加えて攪拌した。
　　　↓10000 rpm、3 min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。
　　　↓クロロホルムを等量加えて攪拌した。
　　　↓10000 rpm、3 min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。
　　　↓3 M  酢酸ナトリウム（pH 5.27）を1/10量加え、イソプロパノールを等量加え、3 min静置した。
　　　↓14000 rpm、10 min、4℃で遠心後、上清を捨て70％エタノールを200 µL加えた。
　　　↓15000 rpm、5 min、4℃で遠心後、上清を捨て乾燥させた。
　　　↓乾燥後、milliQ44 µLを加えて攪拌した。
　　　この溶液にXhoIを1 µL、10×H Bufferを5 µLを加え、37℃で20時間静置した。



9月16日（金）

松浪、横井川

【目的】
　PCR産物の制限酵素処理

【実験操作】
　(1)PCR産物の精製（フェノールクロロホルム処理・エタノール沈殿）
　　　PCR産物を400 µLまでmilliQで薄め、フェノールクロロホルムを400 µL加えて攪拌した。
　　　↓10000 rpm、3 min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。
　　　↓クロロホルムを等量加えて攪拌した。
　　　↓10000 rpm、3 min、4℃で遠心後、水層のみを新しいチューブに移した。
　　　↓3 M  酢酸ナトリウム（pH 5.27）を1/10量加え、イソプロパノールを等量加え、3 min静置した。
　　　↓14000 rpm、10 min、4℃で遠心後、上清を捨て70％エタノールを200 µL加えた。
　　　↓15000 rpm、5 min、4℃で遠心後、上清を捨て乾燥させた。
　　　乾燥後、TE44 µLを加えて攪拌し-20℃で保存した。













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